抗体酶与酶修饰及活性调

抗体酶与酶修饰及活性调第1页/共94页什么是抗体酶？●在免疫球蛋白的易变区赋予酶的属性，成为具有催化活性的抗体●生物学与化学的研究成果在分子水平上交叉的产物●抗体的多样性+酶分子的高效催化=新酶设计●酶反应过渡态类似物作为半抗原免疫动物产生有催化活性的抗体，采用单克隆抗体技术获得这种具有酶特性的抗体。第2页/共93页

牛牛文库文档分享第2页/共94页基本概念①

免疫？②抗体？③抗原？④半抗原？⑤多克隆抗体？⑥

单克隆抗体？第3页/共93页

牛牛文库文档分享第3页/共94页免疫系统和免疫球蛋白功能

免疫是人类和脊椎动物最重要的防御机制，免疫系统能在分子水平上识别“自我”和“非我”，然后破坏那些被鉴定为非我的成分。在生理水平上免疫系统对入侵的反应或应答是多种类型的蛋白质、分子和细胞之间的一套复杂而协同的相互作用，如果从个别蛋白质水平来看，免疫反应可以看作是一种配体与蛋白质可逆结合的生化系统。1．抗原、抗体和免疫球蛋白的概念2．免疫球蛋白的类别3．免疫球蛋白结构和免疫系统4．多克隆抗体和单克隆抗体第4页/共93页

牛牛文库文档分享第4页/共94页什么是“免疫球蛋白”？(immunoglobulin)具有抗体活性的动物蛋白,是一种糖蛋白。主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。可分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的70%，分子量约15万，含糖2～3%。IgG分子由4条肽链组成。其中分子量为2.5万的肽链，称轻链，分子量为5万的肽链，称重链。轻链与重链之间通过二硫键（—S—S—）相连接。免疫球蛋白是机体受抗原（如病原体）刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。另一方面，免疫球蛋白有时也有致病作用。临床上的过敏症状如花粉引起的支气管痉挛，青霉素导致全身过敏反应，皮肤荨麻疹（俗称风疹块）等都是由免疫球蛋白制剂能增强人体抗病毒的能力，可作药用。如注射人血清或人胎盘中提取的丙种球蛋白制剂可防治麻疹、传染性肝炎等传染病。

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牛牛文库文档分享第5页/共94页人免疫球蛋白的分类

IgGIgAIgMIgDIgE重链类别轻链类别或或或或或链的组成

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牛牛文库文档分享第6页/共94页第7页/共93页

牛牛文库文档分享第7页/共94页免疫球蛋白IgG的一级结构

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牛牛文库文档分享第8页/共94页IgG结构第9页/共93页

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IgM的一级结构第10页/共93页

牛牛文库文档分享第10页/共94页IgG的空间结构

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牛牛文库文档分享第11页/共94页IgG与抗原形成

的交联晶格

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牛牛文库文档分享第12页/共94页多克隆抗体和单克隆抗体

如果给动物注射抗原,虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和性有所不同,但是还是有大量抗体产生细胞将与之结合,结果血液中出现的抗体源于数种不同的细胞克隆，这些抗体就是多克隆抗体（polyclonalantibodies）。如果可以分离到抗体产生细胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备的抗体称为单克隆抗体（monoclonalantibodies）。由于单抗细胞的寿命有限，严重限制了单抗的常规制备。1975年，Milsetein和Kohler创建了不受限制地大量制备针对特异抗原的单抗技术，将可产生专一性抗体的B淋巴细胞与具有无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞（骨髓瘤细胞）融合，融合体称为杂交瘤细胞，它既可以永久地培养，又可分泌大量的均一的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高的专一性，现已成为研究的常用工具。第13页/共93页

牛牛文库文档分享第13页/共94页抗体和酶的特点比较

酶

抗体底物结合专一性比较高非常高底物结合形变容易变形不易变形种类比较多非常多物质转变活性高无

如何将抗体转变成酶？第14页/共93页

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抗体酶研究背景●1948年LinusPauling提出了酶的过渡态催化理论,认为酶和底物结合不是在基态上，因为酶与基态底物的结合十分困难，需要克服很大的能障。过渡态结构十分容易与酶结合，因为酶结构经过底物诱导等，亲和力最强。十分容易越过能障，加速催化速度。所以酶具有催化速度快和高选择性（专一性）第15页/共93页

牛牛文库文档分享第15页/共94页①

在没有催化剂存在的情况下，能障（即活化能）是S和S‡之间的能量差。在有酶催化时，能障是ES和ES‡间的能量差。这种能量差越小，过渡态就越容易达到，过渡态的浓度越高，反应速度就越快。②ES‡具有的自由能显然比S‡的低。第16页/共93页

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ES与过渡态（ES‡）是不同的概念。酶促反应速度由ES和ES‡之间的能量差决定！这个差值越小，酶促反应速度就越快。在有催化剂存在下，ES和ES‡之间的能量差显著减小第17页/共93页

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ES复合物是不稳定的，它容易解离成E＋S。在ES复合物中，底物与酶的结合并不是处于最适状态，即不是处于完全互补的状态。换句话说，酶活性部位的基团以及能与底物发生弱的相互作用的氨基酸残基并未全部参与到同底物的结合中去。只有当ES进行转变，进入到转换态ES‡，才能使底物处于一种最适的结合状态。

这就是说，底物与过渡态的酶是互补的!第18页/共93页

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应当注意！转换态本身是不稳定的，但由于转换态与酶的互补结合是由众多的相互作用所释放出的能量(即所谓结合能)使转换态变得稳定。第19页/共93页

牛牛文库文档分享第19页/共94页●在70～80年代，W.P.Jencks预言，抗某个反应过渡态的抗体具有催化该反应的能力。●1975年前后，抗体酶处于探索的开始阶段，一般采用诱导法、引入法进行尝试，一般效率很低，

有的还测定不出活性。主要原因是具有催化活性的抗体太少，在大量的抗体中只有少数几个有活性，甚至都没有活性。●1975年时，G.Kohler&C.Milstein

发明了单克隆抗体技术后，就有了后来的抗体酶。第20页/共93页

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●1986年，美国的Schultz小组研究“对硝基苯酚磷酸胆碱脂（pNPPC）”相应的羧酸二酯水解反应的过渡态类似物时，推测用这个过渡态类似物作半抗原

这样的分析，后来的确从中 选出了两株有催化活性的单 克隆抗体,一株MOPC167的 水解速度达到了1.2x104倍。 经过测定，这个抗体酶符合米氏方程，具有底物专一性需要一定的温度等酶的催化特征。

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牛牛文库文档分享第21页/共94页第22页/共93页

牛牛文库文档分享第22页/共94页结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。另一实验：合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物

用这个过渡态类似物作半抗原免役小鼠，得到12株单抗。第23页/共93页

牛牛文库文档分享第23页/共94页结果：

3株有抗体酶活性，其中一株6D4能与半抗原分子结合外，还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸酯化合物水解，速度快103倍，具有底物专一性和对pH的依赖性。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。还发现单抗的结合位点的氨基酸改变，可以影响它的催化活性。后来，有了成功的经验后，抗体酶的研究文章越来越多。第24页/共93页

牛牛文库文档分享第24页/共94页抗体酶的作用特点：●在专一性方面超过或相当于我们讲的普通酶。●在反应速度方面接近普通酶，目前在总体上要

低一些。

▲原因：抗体酶没有结构诱导等动态变化；产物释放困难；底物、产物的交换困难。第25页/共93页

牛牛文库文档分享第25页/共94页抗体酶的制备一、酶蛋白诱导法二、半抗原诱导法三、抗体分子修饰法（引入法）第26页/共93页

牛牛文库文档分享第26页/共94页O–C–A.酯酶的底物–酯B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物磷酸酯类似物(半抗原)对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体免疫免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体第27页/共93页

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酶蛋白诱导法（拷贝法）●用已知的酶作为抗原对动物进行第一次免疫,获得该酶的抗体;再用这种抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗体,抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。优点:可以大量生产单克隆的抗体酶缺点:有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。酶第一次免疫抗酶抗体第二次免疫抗体酶拷贝法制备抗体酶第28页/共93页

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半抗原诱导法（细胞融合法）●先用特定的半抗原(过渡态底物决定)与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)。此偶联的物质作为抗原

免疫动物，产生抗体

产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合，然后在体外培养，杂交体克隆化，然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。

用标准单克隆抗体技术来制备、分离、筛选抗体酶关键：用什么样的抗原才能诱导出具有特定的酶催化功能的抗体？即由抗体向酶的转变过程。aa过渡态类似物载体蛋白抗体酶半抗原诱导法制备抗体酶第29页/共93页

牛牛文库文档分享第29页/共94页引入法(辅助因子）：●是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质工程方法，将催化基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。●Schultz等人在IgAMOP315抗体结合部位选择性引入巯基，然后用亲和色谱纯化。结果：它水解香豆酯的速度比对照高6×104倍●酶的活性中心很多有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，半抗原分子带有一肽键,通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连,再共价连接在载体蛋白上，免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达6×104。第30页/共93页

牛牛文库文档分享第30页/共94页●吸毒是一个困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上瘾后很难戒掉。目前，直接拮抗可卡因上瘾的抗体还没有找到。●替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子，然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生，必须使用高剂量的抗体,使这一应用受到限制。●抗体酶则不一样，不但能和抗原结合，而且能使抗原水解而再生，这不但能减少抗体酶的用量，也能减少抗体酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用前景更好。抗体酶用于戒毒第31页/共93页

牛牛文库文档分享第31页/共94页Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。

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牛牛文库文档分享第32页/共94页酶活性的调节一、共价修饰酶活性的调节二、酶原活性的调节三、同工酶与酶活性调节四、激活剂和抑制剂对酶活性的调节（略）第33页/共93页

牛牛文库文档分享第33页/共94页共价修饰酶活性的调节

某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。

由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）P2第34页/共93页

牛牛文库文档分享第34页/共94页蛋白质的磷酸化和脱磷酸化

蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型

第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型第三类：双重底物型第35页/共93页

牛牛文库文档分享第35页/共94页反应类型共价修饰被修饰的氨基酸残基共价修饰反应的例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型

Cys第36页/共93页

牛牛文库文档分享第36页/共94页糖原磷酸化酶的结构和作用机制

糖原磷酸化酶是由两个相同的亚基构成的二聚体，每个亚基都有一个大的N-端结构域（484个残基）和一个小的C-端结构域。第37页/共93页

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级联系统调控糖原分解示意图意义：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式快速、效率极高。肾上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（无活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（无活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶b（无活性）磷酸化酶a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATPADPATPADP肾上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456

（极微量）

（大量）第38页/共93页

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糖原磷酸化酶以两种构象状态存在，即有活性的R态和低活性(或无活性)的T态。AMP启动向R态构象转变，而ATP、葡萄糖-6-磷酸等则有利于向低活性的T态转换。糖原磷酸化酶和糖原合酶的别构调节第39页/共93页

牛牛文库文档分享第39页/共94页糖原磷酸化和糖原合酶的共价修饰调节

糖原磷酸化酶存在两种形式，即低活性的磷酸化酶b和有活性的磷酸化酶a,

相应的“转换酶”能将低活性的b形式转变成有活性的a形式。这种转换涉及到磷酸化的共价修饰机制.第40页/共93页

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共价修饰调节也是GS活性调节的一种重要的方式。GS的共价修饰调节是通过腺苷酸化（降低或失去活性）和去腺苷酸化（恢复活性）来实现的。GS的腺苷酸化是由腺苷酰基转移酶催化的。GS亚基397位的Tyr残基的腺苷酸化，增大了对累积方式反馈抑制的敏感性，因而使GS的活性降低。GS的活性降低取决于它的腺苷酸化的程度。

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腺苷酰基转移酶与一种叫做PⅡ的四聚体蛋白形成一种复合物（图）。当PⅡ尿苷酸化时，该复合物使GS去腺苷酸化。当PⅡ失去尿苷酸时，该复合物使GS腺苷酸化。PⅡ尿苷酸化的水平又取决于同一蛋白上的尿苷酰基转移酶（它使PⅡ尿苷酸化）和去尿苷酰基酶（它使PⅡ去尿苷酸化）两种酶的相对活性。尿苷酰基转移酶的活性可被α-酮戊二酸和ATP激活，但可被Gln和Pi抑制。去尿苷酰基酶对这些代谢物是不敏感的。这种代谢级联反映E.coliGS对细胞氮素的需要极端灵敏。腺苷酰基转移酶尿苷酰基转移酶第43页/共93页

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酶原的激活

酶原——生物体自身合成的、没有活性的酶前体。2.酶原的激活——酶原在一定条件下，从无活性转变成有活性的过程。3.酶原激活机制——切除某一肽段4.酶原激活的生理意义

（1）避免对细胞的自身消化（2）酶原到达特定部位才发挥作用第44页/共93页

牛牛文库文档分享第44页/共94页胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意图第45页/共93页

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从无活性的蛋白质原或酶原转变成有活性的蛋白质或酶的过程即称激活或活化。酶原的激活（胰凝乳蛋白酶原激活过程）第46页/共93页

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激活的关键是选择性地切断了Arg15和Ile16之间的肽键，使Ile16游离。在中性条件下，Ile16的α﹣NH3＋能和Asp194的β﹣COO－通过静电作用形成离子键，有助于Ser195和His57之间以及His57和

Asp102之间通过氢键形成一个“电荷转接系统”，使Ser195的侧链具有更强的亲核性，有利于和底物进行作用，于是就表现出胰凝乳蛋白酶的完整的催化功能。第47页/共93页

牛牛文库文档分享第47页/共94页胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶第48页/共93页

牛牛文库文档分享第48页/共94页.第49页/共93页

牛牛文库文档分享第49页/共94页酶的多种分子形式——同工酶概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织，同一细胞的不同亚单位，具有不同分子形式（结构、分子量、等电点），但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）。乳酸脱氢酶是研究得最多的同工酶。生物学功能：遗传的标志和个体发育及组织分化密切相关适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要第50页/共93页

牛牛文库文档分享第50页/共94页乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽亚基mRNA四聚体结构基因a

b乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线第51页/共93页

牛牛文库文档分享第51页/共94页不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)

心肌肾肝骨骼肌血清-+原点第52页/共93页

牛牛文库文档分享第52页/共94页同工酶在各学科中的应用(1)遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。(2)发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。(3)生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。第53页/共93页

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同一种酶的不同的同工酶在对底物的亲和力和Vmax以及对产物所造成的抑制作用的敏感性等通常都是不同的，这反映出代谢上的需要。谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)是氮素代谢中的一种重要的酶，该酶催化依赖于ATP、由谷氨酸和NH4＋合成谷氨酰胺的反应。在高等植物的叶片中，大多存在两种不同类型的GS同工酶，即胞质型的GS1和叶绿体型的GS2。这两种同工酶在发育上以及在代谢中起着非重叠的作用。

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牛牛文库文档分享第54页/共94页酶生物合成的调节——操纵子模型（原核生物）第55页/共93页

牛牛文库文档分享第55页/共94页原核生物酶生物合成调节的必要性生活环境变化大、食物供应无保证根据环境条件合成不同的蛋白质代谢与环境变化适应、维持生存与繁衍组成型酶适应型酶第56页/共93页

牛牛文库文档分享第56页/共94页原核生物酶生物合成调节的总体原则●负责某个代谢过程的酶体系往往在需要时打开，而不需要时则关闭，构成一个基因表达调控的“开－关”系统。●基因表达？基因表达调控？★转录水平★mRNA加工成熟水平★翻译水平★翻译后水平？●营养状况、环境因素、激素水平、发育阶段原核生物（细菌）真核生物（动物）第57页/共93页

牛牛文库文档分享第57页/共94页转录水平的调节至关重要1、代谢产物对酶基因表达的调节

2、弱化/衰减子对酶基因表达的调节

3、降解物对酶基因表达的调节调节物与DNA结合?

正调节

负调节

是开启关闭否关闭开启第58页/共93页

牛牛文库文档分享第58页/共94页代谢产物调节（1）可诱导调节★酶基因在特殊代谢物或化合物的作用下由原来的关闭状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化（进入转录状态）。★大肠杆菌乳糖操纵子（2）可阻遏调节★原来处于工作状态（合成相关代谢酶）的基因由于受到某种特殊代谢物或化合物积累的影响而关闭，即在某些物质的作用下基因去活化（停止转录）★大肠杆菌色氨酸操纵子第59页/共93页

牛牛文库文档分享第59页/共94页弱化子调节★信号分子：具有特殊负载的氨酰－tRNA★弱化子：操纵子被阻遏，mRNA合成被终止时，起转录终止信号作用的核苷酸序列。第60页/共93页

牛牛文库文档分享第60页/共94页酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物第61页/共93页

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根据细菌酶的合成对环境的反应不同，酶的合成可分为两种类型：组成酶和适应酶。适应酶可分为诱导酶和阻遏酶。

1961年，法国科学家Jacob和Monod根据酶合成的诱导和阻遏的现象，提出了操纵子（operon）模型。操纵子是指编码一特定代谢途径酶的结构基因和控制这些基因转录的控制顺序所构成的转录单位。（这样的转录单位在原核生物中即称为操纵子。）

一)．乳糖操纵子（lacoperon）是酶诱导合成的例子1.乳糖操纵子的组织结构结构基因：Z基因―――编码β－半乳糖苷酶。

Y基因―――编码半乳糖苷透过酶

A基因―――编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶操纵基因（operator）:是阻遏蛋白结合部位。启动基因（又称启动子，promoter）:是RNA聚合酶结合的部位。第62页/共93页

牛牛文库文档分享第62页/共94页第63页/共93页

牛牛文库文档分享第63页/共94页第64页/共93页

牛牛文库文档分享第64页/共94页第65页/共93页

牛牛文库文档分享第65页/共94页第66页/共93页

牛牛文库文档分享第66页/共94页第67页/共93页

牛牛文库文档分享第67页/共94页2.乳糖操纵子的调节在含有Glucose作为碳源的培养基中培养E.coli时，调节基因（i）表达的产物阻遏蛋白结合到操纵基因上，阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。与乳糖利用有关的酶不能合成。（这时合成与乳糖利用有关的酶则是一种浪费）。在以乳糖为唯一碳源时，乳糖或它的异构体别乳糖（1,6－allolactose）作为效应物，与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生改变，失去与操纵基因结合的能力,从而丧失抑制活性,解除了对结构基因的转录的抑制。这里乳糖就作为一种诱导物，诱导与乳糖代谢有关酶的表达。

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牛牛文库文档分享第68页/共94页大肠杆菌乳

糖

操

纵

子

模型调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构

B、乳糖酶的诱导

乳糖

阻遏蛋白（有活性）第69页/共93页

牛牛文库文档分享第69页/共94页第70页/共93页

牛牛文库文档分享第70页/共94页第71页/共93页

牛牛文库文档分享第71页/共94页分解代谢物阻遏

当E.coli在含有Glucose的培养基中生长时，培养基中即使含有乳糖，在Glucose被用完之前，是不会产生与乳糖利用有关的酶的，这种效应称为Glucose效应或分解代谢物阻遏。第72页/共93页

牛牛文库文档分享第72页/共94页因为乳糖操纵子的启动子可分为两部分：▲RNA聚合酶结合部位:富含A·T对，并在它的侧翼富含G·C对▲CAP（orCRP）识别/结合部位:富含G·C对，且是回文结构。CAP叫做分解代谢物基因活化蛋白（CRP称为cAMP－受体蛋白）它能使G·C对变得不稳定，可促进A·T对分开，从而有利于转录。但CAP的活性受cAMP水平的调节。当cAMP与CAP结合后才能使CAP同启动子的CAP结合部位结合。CAMP的水平受Glucose的某种分解代谢物的影响,该代谢物可以抑制细菌腺苷环化酶的活性，激活磷酸二酯酶的活性，因而可以降低cAMP的浓度.所以当有Glucose存在时,细胞内的cAMP水平显著下降。这样cAMP－CAP的浓度降低，不能促进RNA聚合酶进行转录，也就抑制了酶的诱导合成。只有当以乳糖作为唯一碳源时，才不会存在Glucose的分解代谢物阻遏的现象。这时，cAMP－CAP的水平升高，在乳糖的诱导下即可合成与乳糖代谢有关的酶。第73页/共93页

牛牛文库文档分享第73页/共94页CAP叫做分解代谢物基因活化蛋白(CRP，即cAMP-受体蛋白)它能使G·C对变得不稳定，可促进A·T对分开，从而有利于转录第74页/共93页

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牛牛文库文档分享第75页/共94页乳糖操纵子的降解物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCGP(CAP)OCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCGP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）

CAP：环腺苷酸受体蛋白（cycilicAMPreceptorprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态第76页/共93页

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cAMP－CAP复合物系统是以cAMP为信号的正调节系统。它对所有分解代谢物敏感的操纵子（包括lac和ara-operon）都有控制作用。在这里，乳糖利用酶的表达受到双重控制，即以乳糖为诱导物的“精调”以及以cAMP为信号的“中调“控制。第77页/共93页

牛牛文库文档分享第77页/共94页色氨酸操纵子是酶合成阻遏调节的例子

在合成代谢中，催化氨基酸或其他小分子最终产物合成的酶随时都需要，细胞中的这些酶经常在合成,即这些酶的合成经常处于去阻遏的状态。所以，在这类操纵子中，调节基因的产物——阻遏蛋白是不活泼的，不能和操纵基因结合.

当合成途径中的最终产物过量时，它就与阻遏蛋白结合，激活阻遏蛋白。激活后的阻遏蛋白就能结合到操纵基因上，阻止RNA聚合酶对结构基因的转录，与合成反应有关的酶也就不能被合成。最终产物或其衍生物称为辅阻遏物。E.coli和鼠伤寒沙门氏菌的色氨酸操纵子调节即是这种阻遏调节的典型。第78页/共93页

牛牛文库文档分享第78页/共94页1.色氨酸操纵子（trpoperon）的组织结构

结构基因（A.B.C.D.E）编码从分支酸开始到色氨酸合成的五种酶。trpL编码一个前导肽。在trpL中有一段序列被称为attenuator（弱化基因或者衰减子）。此外，同样存在操纵基因和启动基因。2.终产物Trp对trpoperon的调节

Trp作为一种辅阻遏物激活阻遏蛋白。当培养基中含有丰富的Trp或者它的合成过量时，即可激活阻遏蛋白（trpR的产物），激活后的阻遏蛋白即可结合到operator上，阻止RNA聚合酶对结构基因的转录，从而停止与Trp合成有关的酶的合成。于是Trp合成便停止。第79页/共93页

牛牛文库文档分享第79页/共94页trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA邻氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶链链分支酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖基邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物转录没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。第80页/共93页

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