抗体制药456节的学习材料

抗体制药456节的学习材料第1页/共39页

抗体研究进展3个阶段：①1890年Behring发现白喉抗毒素，特点：多克隆抗体；②1975年Kǒhler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体；③1994年Winter基因工程方法制备抗体。第2页/共39页Winter等人建立了噬菌体抗体库，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，获得了人源性基因工程抗体。在此之前，基因工程抗体技术只能对已有的单体进行改造，而抗体库技术的诞生却可以不通过动物免疫和细胞融合便可以从抗体库中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生产出来。抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新的时期。第3页/共39页抗体库技术的生产与发展基础在于两项关键技术的突破，一是PCR技术的应用使得人们可以利用一组引物扩增出全套免疫球蛋白的可变区的基因；二是从大肠杆菌中直接表达出有功能活性的抗体分子片段。基因原理是将某种动物的所有抗体可变区的基因克隆在质粒或噬菌体载体中进行表达，分泌，然后通过特定的固相化抗原便可筛选出高度特异性抗体基因的克隆。该抗体库又称全套抗体库或组合抗体库。第4页/共39页用基因工程的方法可以将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，在数日内就可筛选出阳性克隆。第5页/共39页一、噬菌体抗体库技术的基本方法⒈获取目的基因（RT-PCR）⒉抗体库技术的载体（噬菌粒phagemid为载体）具有噬菌体与质粒特点、转化效率高、库容量大⒊淘筛抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增。⒋表达与鉴定（Westernblot）第6页/共39页噬菌体抗体库的技术流程采集淋巴细胞，杂交瘤细胞株等提取mRNART-PCR获得VH，VL基因构建分别表达VH，VL的载体扩增后克隆至同一噬菌体转化至大肠杆菌或其他表达系统筛选特异性抗体并富集抗体的体外亲和力成熟第7页/共39页二、噬菌体抗体库技术的特点

⒈模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆

⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术可以调出任意抗体基因⒊可获得高亲和力的人源化抗体

抗体基因来自人体第8页/共39页三、基因工程抗体表达⒈原核细胞表达（大肠杆菌）⒉真核细胞表达（酵母菌）⒊转基因植物表达（烟草）⒋转基因动物表达（鼠）第9页/共39页第五节抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用的方法是凝集反应。⒈鉴定病原菌的抗体试剂

⑴常用诊断血清的品种和用途

①沙门氏菌属诊断血清②志贺氏菌属诊断血清③病原性大肠埃希氏菌诊断血清第10页/共39页⑵诊断血清的制备步骤

①制备细菌抗原②免疫动物和制备抗体血清⑶诊断血清诊断方法—直接凝集反应第11页/共39页第12页/共39页⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂⒊妊娠诊断试剂⒋抗ABO血型系统血清第13页/共39页第14页/共39页二、免疫标记技术用的抗体类试剂能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能观察的反应得以显现，因而大幅度提高抗原抗体反应的敏感性，用于对微量抗原物质进行定性或定量检测。⒈荧光抗体诊断试剂

⑴荧光抗体的制备⑵免疫荧光测定方法第15页/共39页⒉免疫酶抗体诊断试剂

⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂①HBsAg酶标诊断试剂②HBeAg酶标诊断试剂第16页/共39页③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标抗体诊断试剂⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体诊断试剂第17页/共39页第18页/共39页⒊放射免疫用抗体诊断试剂

放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。

放射性核素标记抗体的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法第19页/共39页抗原的测定有：①夹心法②间接法③竟争法常用标记抗体试剂有①HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂第20页/共39页②HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂③HIV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂④AFP放射性核素标记抗体诊断试剂⑤CEA放射性核素标记抗体诊断试剂第21页/共39页三、导向诊断药物

放射性核素标记抗体肿瘤放射免疫显像

放射免疫显像优点：①在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺、脑的转移灶。第22页/共39页③小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著提高T/NT值。④抗体在肿瘤部位可保留6～9日⑤能观擦抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。第23页/共39页

放射免疫显像定位技术

将抗肿瘤单克隆抗体（McAb）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成McAb-DTPA，再注入体内后，就能与体内组织相结合。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金属离子络合剂，所以In-113M可以结合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在2小时内可完成。第24页/共39页

建立预定位技术需解决3个问题：

①抗体在肿瘤组织滞留要7天以上;在肿瘤组织内的量要满足显像要求。②Ab-DTPA偶联物比较稳定。③内源性金属离子对DTPA的封闭作用要小。第25页/共39页第六节抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。治疗用的制剂尚未达到商品化程度。障碍：分子量大，排斥反应一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便、用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。第26页/共39页二、抗癌药物偶联的抗体药物⒈常用的抗癌药物

氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）、环磷酰胺（CTX）等。以人血清白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性提高2倍。第27页/共39页⒉抗体类药物逆转耐药性

肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDR）。

MDR是由基因调控的，其编码蛋白称为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由Mdr1基因编码，1280个氨基酸残基，相对分子质量170~180K的跨膜蛋白。第28页/共39页耐药性产生的机理P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。第29页/共39页

三、毒素偶联的抗体药物

⒈免疫毒素及其换代制品

在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链的非特异性结合，使其仅能在体外应用。第30页/共39页

第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链作用相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。

第31页/共39页第三代免疫毒素是重组免疫毒素，用基因重组技术改造毒素基因，去除非特异性结合部位，明显降低了毒性反应。改造的毒素基因与小分子抗体基因重组后进行表达，所以，特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫原性低。第32页/共39页⒉免疫毒素的制备方法⑴毒素的来源：细菌毒素植物毒素⑵载体的种类载体主要作用是将毒素携带至靶细胞表面，并与其结合，使毒素进入细胞内起作用。主要有：①小分子抗体FV或SCFV②细胞生长因子③激素④CD4第33页/共39页

⑶制备方法先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因再与载体基因cDNA重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。第34页/共39页⒊免疫毒素的临床应用治疗肿瘤、自身免疫病、并能克复组织移植排斥反应。由于重组免疫毒素是在胞浆物质代谢中发挥作用，相对分子质量又小，渗透力强，所以效果好。第35页/共39页随着技术的进步，越来越多的抗体走向临床，成为攻克疾病的有力武器。根据互联网（）的资料统计（2000年），在369种进行临床研究（pipeline）的生物药品中，抗体就占了59种，是除疫苗以外种类最多的。抗体可变区序列的多样性决定其结合抗