分子生物学综合性试验讲义

本文格式为Word版，下载可任意编辑——分子生物学综合性试验讲义

分子生物学综合性试验

生命科学与生物制药学院

生物制药研究所

分子生物学综合性试验教学小组

2023年12月

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分子生物学试验内容与流程

一、试验内容1、小鼠肝脏总RNA提取

2、RT-PCR、扩增产物电泳鉴定与纯化3、扩增产物克隆

4、转化子筛选与PCR鉴定5、重组质粒提取与酶切鉴定

二、流程

日期试验内容

20/12：小鼠肝脏总RNA提取RT-PCR：逆转录、-20℃冻存

21/12:RT-PCR：PCR

RT-PCR产物电泳鉴定与回收

接种DH5α2

22/12

23/12

24/12

RT-PCR产物与T载体连接转化、涂平板转化子蓝白斑筛选转化子PCR鉴定重组子接种重组子质粒制备重组子酶切鉴定

宿主菌感受态制备3

试验要求与质量控制

综合试验涉及的知识点和试验技术众多，为了培养学生严谨求实、科学求真之精神，并达到综合试验之最大成效，以下对本综合试验过程的要求进行说明，且纳入试验考核成绩。

1、预习

试验前须充分预习，要求随机抽查时，每一位同学能够明了的阐述整体试验思路和具体的试验项目、原理。

2、试验过程

除了遵守学校与学院一般试验纪律与要求外，还必需做到主动性、能动性与团队精神相接合，利用有限的资源与时间得到最好的培训与试验结果。为此，本综合试验将能否在规定时间内完成试验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一，并作为考核结果记入试验成绩中。要达到此目的，同学们必需提前细心阅读试验讲义，全面了解试验内容，透彻理解试验原理，熟悉各个操作步骤，并在试验过程中合理安排时间。

3、试验原始记录与结果整理

每天必需及时、真实、完整地记录当天所做试验状况，记录试验过程中的异常状况，分析其原因，并将下述关键性试验状况整理于试验记录本上，并于当天由带教老师签阅：

1）记录日期、天气2）试验名称、负责人3）原理（简述）4）实际操作状况5）试验结果6）分析

4、综合试验报告

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须按下述规范撰写、并提交综合试验报告（电子版及电子打印版）。1）封面：

见下一页。2)论文内容目录中文摘要英文摘要前言材料与方法结果与探讨

1．总RNA提取与RT-PCR：PCR产物电泳凝胶扫描图、PCR产物回收电泳凝胶扫描图。

2．RT-PCR产物克隆：转化筛选平板照片3．重组子PCR鉴定：PCR鉴定电泳凝胶扫描图4．重组质粒提取与酶切鉴定：酶切鉴定电泳凝胶扫描图

分子生物学综合性试验论文

小鼠β-actin基因的克隆

姓名：…………班级：…………学号：…………

生命科学与生物制药学院

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试验一小鼠肝脏总RNA提取

试验目的

1．把握真核细胞总RNA提取的方法与本卷须知2．了解真核细胞总RNA提取的原理

试验原理

RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。利用提取的RNA人们可以对特定的基因表达进行定性和定量检测，从分子水平确切的了解细胞生命活动的规律。

寻常一个典型的哺乳动物细胞约含有10-5μgRNA，其中约82%为rRNA（主要是28S、18S和5.8S、5S四种类型），16%为tRNA和核内小分子RNA，2%为mRNA。这些高峰度的RNA，如rRNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析（HPLC）分开。而mRNA虽然大小和核苷酸序列各不一致，从数百至数千碱基不等，但大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)组成的尾，其长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸—纤维素[oligo(dT)]，使得mRNA可以利用亲和层析法分开。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。

真核细胞总RNA制备方法有多种，包括异硫氰酸胍—氯化铯超速离心法、盐酸胍—有机溶剂法、氯化锂—尿素法、热酚法以及Trizol试剂提取法等。目前试验室提取总RNA的常用方法为异硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和Trizol试剂提取法。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA，是将已知最强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，加强了核蛋白复合物的解离，使RNA和蛋白质分开并进入溶液，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，简单被异丙醇沉淀浓缩。我们这次试验采用的是Trizol试剂提取法。TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分开，并将RNA

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释放到溶液中，同时还抑制RNA酶，防止RNA的降解。当参与氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚使蛋白变性，可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分开开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

RNA极不稳定，易于降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时关键因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。

1．抑制内源性RNA酶。

主要运用RNA酶抑制剂，目前常用的RNA酶抑制剂有：①RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)，它是从人胎盘分开的一种蛋白质，可以与多种RNA酶紧凑结合形成非共价结合的复合物，使RNA酶失活。RNA酶抑制剂经数次冻融后或放在氧化条件下应弃之不用。RNA酶抑制剂不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译；②氧钒核糖核苷复合物，它是由氧钒离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态似物，它能与多种RNA酶结合并高效抑制RNA酶活性。然而氧钒核糖核苷复合物能猛烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必需用含0.1%羟基喹啉的苯酚屡屡抽提以除之；③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后续的RNA纯化过程中经离心除去；④异硫氰酸胍，它是强力的蛋白质变性剂，在破坏细胞结构使核酸从细胞核中解离出来的同时也使RNA酶变性失活；⑤焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶猛烈抑制剂，但其作用并不是绝对的。DEPC主要用于材料和器皿的RNA酶处理；⑥其它化学试剂，如SDS、尿素等对RNA酶也有一定的抑制作用。

2．防止外源性RNA酶污染

外源性RNA酶主要通过以下几个途径污染RNA制品：①玻璃制品、塑料制品和电泳槽；②研究人员造成的污染；③污染的溶液。因此在试验中必需采取以下措施抑制外源性RNA酶：①试验室用的普通玻璃制品和塑料制品经常有RNA酶污染，使用前必需于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15min。RNA电泳槽需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇枯燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1TPC水完全冲洗电泳槽。灭菌

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的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不需要处理；②在RNA提取过程中,应戴一次性手套和口罩,对接触可能污染的器皿时，应勤换手套；③配制的溶液的水应用0.1TPC水在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。对不能高压灭菌的试剂，用经DEPC水配制处理过的无菌蒸馏水配制。

仪器与试剂

1．仪器与材料：

低温高速离心机、移液器、DEPC水处理的EP管与枪头、一次性手套、组织研磨棒、眼科剪、眼科镊、止血钳2．试剂：

Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇

试验步骤

1.吸取500μLTrizol参与一新的DEPC处理后的1.5mLEP中；

2.解剖小鼠，取小鼠肝脏组织，在生理盐水中清洗后，剪成大小约黄豆大小（重量约100mg）,放入已加有500μLTrizol的1.5mLEP中；

3.使用用组织研磨棒快速研磨4-5次，之后再参与500μLTrizol，继续快速研磨2-3次研磨组织直至溶液变粘稠，室温放置5min使其充分裂解；4.12000rpm离心5min，将上清转移至一新的DEPC处理后的1.5mLEP中；5.参与200μL氯仿，振荡混匀，室温放置3min；6.12000rpm离心15min；

7.离心后混合物分为三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。防备移取上层无色水样层，转移至另一新EP管中；

8.参与500μL异丙醇，室温放置15min；

9.12000rpm离心15min，这时会在EP管的底部看到白色沉淀；轻轻弃去上清；10.参与1mL75％乙醇（用DEPC处理的水配制）洗涤RNA沉淀；11.7500rpm离心5min,弃上清；12.将EP管倒置，枯燥，挥发剩余的乙醇；

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13.用适量DEPC处理的水溶解RNA沉淀，推荐20μL。

本卷须知

1.研磨组织块用于RNA提取的样品,必需是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能马上用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。2.研磨过程中要尽量避免Trizol的溢出。

3.有屡屡离心过程，注意配平，防止出现事故以及对离心机的损害。4.整个抽提过程，要尽量避免RNase的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物试验操作习惯，预防微生物污染。

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试验三RT-PCR产物克隆

试验目的

1．把握DNA体外重组的原理与方法。

2．了解大肠杆菌氯化钙法制备感受态的原理，把握制备的方法。3．把握大肠杆菌转化原理与方法。

试验原理

RT-PCR反应之后，TaqDNA聚合酶一般会在目的基因的3’末端添加上一个A碱基，而T载体的3’末端附带一个T碱基，扩增产物与T载体在连接酶的作用下，通过碱基互补配对作用，就可形成稳固的重组克隆载体。

受体细胞经过一些特别方法（如：电击法、CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。之后采用适当的方法使载体DNA分子进入受体细胞。本试验通过42℃热激、冰浴冷却的方法将外源DNA载体分子转化入宿主细胞内。

仪器与试剂

1仪器

移液器（0.5-10微升、10-200微升，100-1000微升的量程）恒温水浴锅（16℃），冰盒，超净工作台，培养箱，摇床，玻璃试管，离心机，玻璃棒。2试剂

pMD19-T载体试剂盒，0.1MCaCl2。3菌株与培养基

大肠杆菌DH5α；LB(Amp-)培养基，含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板。

试验步骤

1.PCR产物与T载体的连接

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（1）在清白的0.2ml的Eppendorf管中依次参与以下各组分：试验组（每组做一个）：

ddH2O3μLSolutionⅠ5μLpMD19-T载体1μLPCR产物1μL总体积10μL

对照组(一个班做一个，第五组同学做)：

ddH2O3μLSolutionⅠ5μLpMD19-T载体1μLControlInsert1μL总体积10μL

（2）轻混反应物，并在16℃或者室温连接反应30分钟(时间可延长)。2.大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）接种10μL甘油菌至含有2mlLB培养基（Amp-）的试管中，37℃振荡

培养过夜。

注：前一步已经由试验中心老师准备好，同学们只需从下面其次步开始试验。（2）以1%的接种量将甘油菌种30μL接种到3mlLB培养基（Amp-）中，

37℃振荡培养3h(此时菌液的A600值达到0.3～0.4)；（示范操作）

（3）室温下，以5000rpm离心2min，回收细胞；

（4）在超净工作台里用枪头吸取上清弃掉，再用100μL预冷的0.1MCaCl2溶

液重悬菌体（重悬时操作要轻），冰浴放置。3.大肠杆菌的转化（无菌操作）

（1）将连接产物（试验组和对照组）参与到制备好的感受态细胞里，用加样枪

反复吹打，将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴10min；（2）42℃水浴热休克2min，时间到后迅速在冰上冷却10min；（3）参与1mLLB培养基（Amp-），37℃静置0.5~1小时；

（4）5000rpm离心2min，在超净工作台中用枪头吸取800μL上清弃掉，用剩

余的液体将细胞悬浮；

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（5）将悬浮细胞全部吸取并转移至含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板上，用

无菌玻璃棒涂布均匀，37℃倒置培养过夜。

本卷须知：

1、吸取微量液体时务必要防备，确保将其全部转移到反应液中；2、确保反应液混合均匀；

3、为提高转化率，要密切注意细胞的生长状态和密度。

结果分析与探讨：

若转化平板上未能长出菌落，说明转化失败，可能原因有：（1）与T-载体连接试验失败；（2）所制备感受态细胞质量差，重组载体未能成功转入；（3）进入宿主菌的外源载体分子未能表达。

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试验四转化子的筛选及PCR鉴定

试验目的

1．把握蓝白斑筛选的基本原理及具体操作。

2．把握常见的几种鉴定转化子DNA的方法，以及菌落PCR鉴定的原理和方法。

试验原理

现在使用的大量商业化质粒载体(如pUC系列和它们的衍生载体)都带有一段大肠杆菌DNA的短片段，其中含有β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它不破坏阅读框，而不影响其功能。这种类型的载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的片段都没有活性，但它们能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。这样，lacZ基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种互补现象称为α互补。

IPTG（异丙基-β-D-半乳糖苷）是一种乳糖类似物，可使lacI阻遏蛋白失活，从而诱导lac操纵子转录。由α互补而产生的lac+细菌落易于识别，由于它们在生色底物X-gal存在的状况下形成蓝色菌落。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无α互补能力的N端片段。因此，携带重组质粒的细菌形成白色菌落。

这一简单的颜色试验，大大简化了在这种构建质粒载体中鉴定重组子的工作，仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落，并识别可能含有重组质粒的菌落。这样的方法，即称为蓝白斑筛选法。

选择性培养基上长出的菌落，由受体菌DH5α的表型Amp-转变为Amp＋（由质粒提供抗性），且颜色为白色的菌落，证明重组质粒已转化入受体菌，但要证明插入片段的大小和序列，还需进一步鉴定。常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观测其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观测酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定，观测PCR产物的大小是

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否与目的基因大小相符；方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。

本试验将初筛得到的白斑菌落进行菌落PCR分析，观测PCR得到的DNA片段大小是否与预计的相符，从而对重组转化子DNA进一步鉴定。

仪器与试剂

1仪器

1.1涂布器，1个

灭菌试管若干超净工作台1台空气浴水平摇床1台电泳仪及配套电泳槽1台紫外检测仪1台1.2移液器（200-1000μL）1支

移液器（5-200μL）1支移液器（0.5-10μL）1支

2试剂

2.1LB（含Amp）液体培养基15mL

Amp的终浓度为0.1g/L（以1LLB/Amp液体培养基为例，Amp的含量为100mg。）2．2配置1LLB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基（举例说明）：

终浓度试剂用量0.04mg/mLX-Gal40mg0.024mg/mLIPTG24mg1%(W/V)Tryptone10g0.5%(W/V)YeastExtract5g1%(W/V)NaCl10g0.1mg/mLAmpicillin100mg1.5%(W/V)Agar15g

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参与1mL70％的乙醇，用枪头轻轻吹打洗涤沉淀，注意不要将沉淀打碎或吸走

12000r/min离心5分钟，防备用弃去上清，注意不要将沉淀倒走

将EP管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然枯燥

用20μL含RNaseA的无菌蒸馏水溶解提取物，室温放置，充分溶解DNA

2．酶切鉴定

在EP管内参与酶切反应体系（20μL）质粒DNA10μL10×酶切反应缓冲液2μLEcoRI1μLHindIII1μL无菌蒸馏水6μL

离心混匀，37℃水浴反应3－4小时

制备1％的琼脂糖凝胶板

取酶切后全部DNA样品参与上样缓冲液混匀

上样进行琼脂糖凝胶电泳

紫外监测仪观测结果

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2．3菌落PCR：

PCRBuffer、dNTPmix、Primer1#、Primer2#、TaqDNApolymerase、H2O、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、上样缓冲液、DNA染料

试验步骤（以下操作均在超净工作台中进行）

1．蓝白斑平板的制作（此步已由试验准备老师完成，以下平板配置各试剂的剂量以1L为例进行说明）：

（1）称取以下试剂，置于1L烧杯中。

Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g（2）参与约800mL的去离子水，充分搅拌混匀。（3）滴加5NNaOH(约0.2mL),调理PH值至7.0。（4）加去离子水将培养基定容至1L后，参与15gAgar。（5）高温高压灭菌后，冷却至60度左右。

(6)参与1mLAmpicillin(100mg/mL)、1mLIPTG（24mg/mL）、2mLX-Gal（20mg/mL）后均匀混合。

(7)铺制平板（30-35mL培养基/90mm培养皿）。(8)4度避光保存,一般存放24小时后才开始使用。

(9)做转化液涂布平板操作时，提前1-2小时将平板从4度冰箱取出，室温避光温育，以待涂布使用。

（10）见试验三中具体转化操作。

（11）次日从37度温箱中取出平板观测，蓝色菌落即初步认定为未转化菌，白色菌落初步认定为转化子。2．菌落PCR：

（1）按顺序在PCR管中参与

10XPCRBuffer2μL

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dNTPmix1.6μLPrimer1#1μLPrimer2#1μLTaqDNApolymerase0.5μL

ddH2O13.9μL

总体积20μL

（2）常温下随机挑拣一个转化板上的转化子，用灭菌的小枪头挑取少量菌体；

先将小枪头放入一支装有约3mLLB（Amp+）培养基的试管中洗涤2-3次，然后将同一枪头浸入装有PCRmixture的PCR管中反复吹打以作扩增培养细菌用；另取一PCR管，先进行操作（2）的操作，但不加转化子模板，作为阴性对照。将以上两个PCR管微弱离心后，放入PCR仪，设置反应程序：

94℃5min94℃30sec

61.5℃30sec30Cycle72℃1.5min72℃7min4℃

（3）取少量5μLPCR反应产物，1%琼脂糖电泳分析。（4）紫外检测仪下观测并记录扩增片段大小。

注意：电泳时需有标准DNA分子量Marker和不加模板的阴性对照样品（5）上述操作（2）中的洗涤过有菌枪头的试管，空气摇床37℃,180-200rpm

过夜（12-14hr）扩增培养，以备后续试验质粒提取及酶切使用。

本卷须知

1．α互补筛选是十分可靠的，但并非永不出错：外源DNA的插入并不总是激活β-半乳糖苷酶α片段的互补活性。假使外源DNA很小（小于100bp），或者插入片段没有破坏编码框，也没有影响α片段的结构，就可能不会严重影响α互补。虽然这种现象在文献中有所报道，但是极为罕见，因此只对遇到这种问题的

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研究者才有意义。

不是所有的白色克隆都携带重组质粒。Lac序列的突变或者丢失可能掩盖质粒表达α片段的能力。

2．PCR方法操作简便,但影响因素较多,欲得到好的反应结果,需根据不同的DNA模板,摸索最适条件。同时还要注意避免操作中每一步可能造成的人为污染。

结果分析与探讨

1．LB/Amp/X-Gal/IPTG平板存放在4度避光的条件下，要使用时须提前1-2个小时取出，在室温下温育，以供涂布所用。

2．本次试验中所用的质粒为商品化的T载体pMD19-T,在试验过程中会注意到，它的颜色指示，将不如pUC19等质粒在蓝白斑筛选中的颜色指示明显。3．挑取转化子菌落的时候，要注意挑取菌落的位置确凿，沾取到平板上的些许琼脂不太会影响试验结果；用枪头在装有LB（Amp+）培养基的试管中上下2-3次即可，过分洗涤后，会造成PCR反应模版不够，影响试验结果。

先

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试验五重组质粒提取与酶切鉴定

试验原理

用NaOH和SDS破坏细菌包膜，并制造PH12.0~12.6的碱性环境，胞内容物释放出来后，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。当参与高盐的酸性乙酸钾溶液后，PH值调至中性，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA依旧为可溶状态。通过离心就可以除去大部分细胞碎片染色体DNA、RNA和蛋白质，质粒DNA尚在上清中，利用酚、氯仿、异丙醇、乙醇等试剂进一步纯化质粒DNA。

核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，分I、II、III型三种，II型酶是我们分子生物学中最常用的内切酶，试验中使用的EcoRI和HindIII两种内切酶能够识别质粒上的特定DNA序列，并能在识别的序列内切断DNA双链，形成一定长度的DNA片断。

琼脂糖凝胶电泳适用于分开0.2-50kb范围的DNA片断，因DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动，不同DNA分子所带电荷数、分子量大小和构象不同，在同一电场中的泳动速度就不一样，从而达到分开的目的。

仪器与试剂1．质粒提取试剂

1.1含质粒DNA的过夜培养的DH5α菌株LB菌液1.5mL

1.2溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100mL,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱

1.3溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS。溶液Ⅱ需