研究生细胞技术绪论

细胞培养是一种技术，是将真核细胞或原核细胞培养在受人工控制的状态下，使其生长繁殖。这项技术的发展与方法，与组织培养或器官培养关系密切。最早的实验室常态性动物细胞培养，始于1950年。不过早在19世纪，便已经有人提出将活体细胞从原先组织中分离出来的概念。1第一页，共118页。细胞培养技术理论课内容一、绪论二、细胞的体外生长大环境三、培养细胞的生物学特点四、肿瘤细胞培养和杂交瘤技术五、干细胞的研究2第二页，共118页。第一章绪论一、细胞培养技术发展简史二、细胞培养技术基本概念三、对细胞培养技术的评价四、细胞培养的污染问题五、组织工程基本概念六、本室细胞培养与组织工程研究工作简介3第三页，共118页。上世纪初（1907年）美国科学家Harrison和Carrel创建的、以淋巴液为培养基在试管内成功地培养了蛙胚神经组织。50年代在培养容器、培养液及技术操作上都进行了大的改进，使细胞培养进入一个突飞猛进的发展阶段。70年代，随着遗传缺陷细胞株的培育，杂交瘤技术制备单克隆抗体，癌基因转染及基因工程出现，使细胞培养技术不仅用于研究生命科学，也成为生物工程、基因工程和组织工程等学科的生产手段。一、细胞培养技术发展简史4第四页，共118页。细胞（组织）培养细胞（组织）培养的概念和进展：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。二、细胞培养基本概念5第五页，共118页。根据实验目的、观察指标决定组织

（器官）或是单个细胞。细胞培养是用剪碎的小组织块或分离的单个细胞进行培养，这种培养将会失去原有组织类型及某些生化特征，但它们可以增殖，可以特性化，可以获得遗传背景相同的群体，可以保存。培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞（ESC），它们具有更高的自我更新和多能分化的能力。细胞（组织）培养选材二、细胞培养基本概念6第六页，共118页。原代培养一般指细胞从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。二、细胞培养基本概念原代与传代培养7第七页，共118页。传代细胞原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株（Cellstrain）。二、细胞培养基本概念8第八页，共118页。二、细胞培养基本概念9第九页，共118页。细胞纯化当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。二、细胞培养基本概念是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。细胞富集10第十页，共118页。细胞培养重要名词水组成细胞质胶体，是细胞重要的组成部分，占细胞总量的75％～90％。水是细胞内外的溶媒，并且直接参加代谢中的各种反应，制备培养液至少需用不含杂质的蒸馏水。通常将水分为四种：软化水脱盐水（蒸馏水）纯水（去离子水）高纯水（超纯水）11第十一页，共118页。1）软化水：是指硬度降低至一定程度的水。在软化过程中，仅硬度降低而总含盐量不变。2）脱盐水（蒸馏水）：这种水由于去除了强电解质，水质纯，剩余含盐量在1～5mg/L。25℃时用电导仪测水的电阻率为0.1～1.0×106Ω·cm。3）纯水（去离子水）：制备过程是将普通自来水经沙过滤后，再经阳、阴离子交换树脂和阳＋阴混合树脂交换处理。剩余含盐量在0.1mg/L左右。电阻率为1.0～1.0×106Ω·cm。蒸馏水和去离子水均适用于一般培养液的配制。4）高纯水（超纯水）：将纯水再次纯化处理，剩余含盐量在0.1mg/L以下。25℃时，水的电阻率在1.0～1.0×106Ωcm以上。用于配置组织细胞培养液，并需现配现用。

细胞培养重要名词12第十二页，共118页。饱和密度(Saturationdensity)：在特殊培养条件下，每平方厘米(单层培养)或每毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。汇合(Confluent)：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。超汇合(Superconfluent)：单层细胞培养附在底物上生长，汇合后发展成多层状态。细胞培养重要名词13第十三页，共118页。细胞培养重要名词传代(Passage)也称再培养(Subculture)，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。单层细胞培养(Monolayerculture)：培养细胞在底物上生长成单层的培养法。代或世代(Generation)：指细胞经过一次分裂完成后至下次分裂的过程。底物(Substrate)：指供细胞贴附生长的实质性支持面(如塑料和玻璃等)。14第十四页，共118页。细胞培养重要名词二倍体(Diploid)：指双倍数的染色体数或具有此数的细胞系。二倍体细胞系或株(Diploidcelllineorstrain)：具有二倍体染色体数的细胞系或株。非整倍体(Aneuploid)：细胞染色体数为非整倍数(人23n)的核型。15第十五页，共118页。细胞培养重要名词核型(Karyotype)：一个细胞全部染色体的组成和所有特征。合核体(Synkaryon)：两个细胞融合后形成的单核杂种细胞。活力(Viability)：以100个细胞中存活细胞数表示。16第十六页，共118页。细胞培养重要名词接触抑制(Contactinhibition)：指细胞相互接触后失去运动(移动)的现象。接种率(Platingefficiency)：接种细胞培养时细胞能形成克隆的百分数；如每一克隆均来自单个细胞时，则与克隆形成率等同。接种存活率(Seedingefficiency）：接种一定量细胞后，在一定时间内，能贴附于底物上存活细胞的百分数。17第十七页，共118页。细胞培养重要名词近汇合或半汇合(Sub-confluent)：细胞在底物上生长接近但尚未完全汇合的状态(可用而70％、80％或90％等表示)连续细胞系或永生性细胞系或株(Continuouscellline)：具有在体外可反复传代无限增殖能力的细胞群。密度抑制(Densityinhibition)：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。18第十八页，共118页。细胞培养重要名词克隆(Clone)：指由从一个共同的祖先通过无性繁殖而来的、遗传上同一的细胞群或后裔；Clone也可作动词用，用于指细胞形成克隆细胞群的过程，即从群体中把单个细胞分离出来，通过增殖形成细胞群或后裔的过程；用于分子生物学时，既有繁殖意义也有分离的意义，如分子克隆形成率(CloningEfficiency)：向底物接种单细胞悬液能增殖生长形成细胞群的百分数。19第十九页，共118页。细胞培养重要名词平分比数(Splitratio)：细胞再培养时稀释比数；如一瓶细胞分入4份100毫升或400毫升中，则平分比为4。器官培养(Organculture)：在体外维持器官、器官的一部分或器官原基的培养法。群体密度(Populationdensity)：培养底物单位面积上单层细胞数量。群体倍增时间(Populationdoublingtime)：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间。20第二十页，共118页。细胞培养重要名词三维培养(Threedimensionalculture)：把细胞悬液接种在一定立体形态的支架上，使细胞生长在三维环境中的培养方法。.贴壁性或锚着依赖性(Anchorage-dependent)：一些细胞依赖于贴附底物或支持物上才能增殖生长的性状。21第二十一页，共118页。细胞培养重要名词体内(Invivo)：指在整体内。体外培养(Invitro)：原义为在试管中，即指体外，现与组织培养（细胞培养）一词等同。细胞融合(Cellfusion)：指两个独立的细胞借媒介物(PEG等)融合成杂种细胞的过程。细胞一代时间(Cellgenerationtime)：一个细胞二次分裂的间隔时间。22第二十二页，共118页。细胞培养重要名词细胞杂交(Cellhybridization)：两个或多个细胞融合形成一个合核体(synkaryon)的过程。细胞系(Cellline)：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。细胞株(Cellstrain)：通过选择或克隆法，从原代培养物或细胞系所获的培养物。悬滴培养(Suspensionculture)：把培养物滴在无菌盖片上，翻转盖片覆在凹窝玻片上的培养法。23第二十三页，共118页。细胞培养重要名词悬浮培养(Suspensionculture)：细胞在培养液中呈悬浮状态生长的培养方法。亚系(Sub-line)：由原细胞分离出的具有与原细胞系不同性状的细胞系。亚株(Sub-strain)：由原细胞分离出的具有与原细胞株不同性状的细胞株。24第二十四页，共118页。细胞培养重要名词有限细胞系(Finitecellline)：细胞系形成后仅能维持有限传代次数，最后死亡。杂种细胞(Hybridcell)：指由两种不同类型细胞通过融合所形成的新细胞。组织移植(Explant)：指组织块移植培养。25第二十五页，共118页。细胞培养重要名词增代时间(Generationtime)：指细胞一次分裂完了到下一次再分裂的时间（即形成一代的时间）。转染(Transfection)：是指用噬菌体、质粒、病毒等为载体与目的基因构成的重组子后被导入细胞基因组中的过程。染色体组型图(Idiogram)：细胞染色体按形态特征排列的图形。26第二十六页，共118页。

三、对细胞培养的评价（一）培养的组织器官或细胞，能再一定范围和程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物质基础。如：组织（细胞）培养的医学生物学意义

药物筛选，疗剂评价，新生物制品研发，研究病毒及其他微生物，发现新的传染因子，组织工程中的支撑技术等。27第二十七页，共118页。细胞培养技术已经成为商品化生物技术产品的核心。如目前可提供的产品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗和乙肝疫苗等；非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素和集落刺激因子等；多肽生长因子：表皮生长因子和神经生长因子等；酶类：组织型纤溶酶原激活剂；激素：EPO和促黄体生成素等；杀虫剂：杆状病毒；肿瘤特异抗原；癌胚抗原；通过杂交瘤生产的各种单克隆抗体；细胞本身（如干细胞）；皮肤重植等。（二）细胞培养与生物工程三、对细胞培养的评价28第二十八页，共118页。单克隆抗体（单抗）是继疫苗、重组蛋白后最重要的一类生物技术产品，是21世纪生物技术和生物医药产业领域的战略制高点。单抗已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等。29第二十九页，共118页。单抗技术经过35年的发展，历经鼠源性（murine）、嵌合（chimeric）、人源化（humanized）和全人源单抗（humanmonoclonalantibody）四个阶段。30第三十页，共118页。鼠源性单抗由鼠杂交瘤细胞分泌，免疫原性非常强，可诱导产生人抗鼠抗体，毒副作用明显，因而大大制约了其临床应用。全球单抗市场中，人源单抗是其未来的发展方向，已在欧美上市的32个单抗中，有9个是全人源单抗，13个是人源化单抗。（表1）31第三十一页，共118页。32第三十二页，共118页。33第三十三页，共118页。34第三十四页，共118页。35第三十五页，共118页。36第三十六页，共118页。37第三十七页，共118页。38第三十八页，共118页。对于生物技术所使用的各种细胞株的价值，现尚难作出评价。1998年，美国市场就达3.5-4亿美元，而且每年还以6-8%的速度增长。美国细胞株供应公司和机构及国内供应单位可在网上查询。三、对细胞培养的评价（三）细胞培养技术的商业化39第三十九页，共118页。三、对细胞培养的评价invitrogan

有关不同细胞株的用户论坛ATCC

各种细胞株的主要供应者提供有关细胞株的筛选Cellsalive

生产各种细胞感染、凋亡其他细胞过程的录相和图片Gentest

药物代谢试验用的酶和肝细胞主要供应者ExpessionSystems

杆病毒细胞株的主要供应者LifeTech

供应基础研究用的特异化细胞株40第四十页，共118页。三、对细胞培养的评价细胞（组织）培养，包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估都必须考虑这些。（四）组织（细胞）培养的局限性41第四十一页，共118页。微生物是一类肉眼不能直接看见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大几百倍或几万倍后才能观察到的微小生物。根据微生物的细胞结构、分化程度和化学组成，可分为3大类：非细胞型微生物:病毒、朊病毒（朊粒）原核细胞型微生物：细菌、支原体、立克次体、衣原体、立克次体和放线菌。真核细胞型微生物：真菌四、细胞培养的污染问题42第四十二页，共118页。培养细胞的污染概念包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞。四、细胞培养的污染问题细胞培养的检测和排除空气：一般培养室环境中每立方米含菌数不应超过1~5个器材：CO2温箱操作血清组织样本微生物污染的途径43第四十三页，共118页。真菌污染细菌污染支原体污染：可做如下检测相差显微镜检测荧光染色法电镜检查DNA分子杂交或支原体培养方法四、细胞培养的污染问题微生物污染的检测44第四十四页，共118页。把好每一个关口，尽可能禁止任何有污染的物品进入培养操作环节；四、细胞培养的污染问题微生物污染的防治抗生素：一般用常用量的5~10倍作冲击疗法。用药24~48h后，再换常规培养液。加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放置在41℃作用5~10h，最长不超过18h后，以杀灭支原体。动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。45第四十五页，共118页。细菌污染46第四十六页，共118页。无支原体污染的Hela细胞47第四十七页，共118页。Hoechest33258荧光染色检测

细胞培养中支原体污染被支原体污染的Vero细胞48第四十八页，共118页。疑似支原体污染的Vero细胞49第四十九页，共118页。药物清除Vero细胞中支原体污染50第五十页，共118页。透射电镜检测细胞培养中支原体污染51第五十一页，共118页。52第五十二页，共118页。Hoechest33258荧光染色检测细胞凋亡结果发生凋亡的Vero细胞53第五十三页，共118页。正常的HF细胞54第五十四页，共118页。透射电镜检测细胞凋亡结果正常神经元凋亡神经元55第五十五页，共118页。五、组织工程的基本概念56第五十六页，共118页。首次获得由人类胚胎干细胞转化的表皮

据发表在2009年11月21日《Lancet》杂志的一篇研究报告，I-STEM*研究所(I-STEM/

Inserm

UEVE

U861/AFM)由Marc

Peschanski主持的课题组成功地利用人类胚胎干细胞生成一块完整的表皮。该课题组希望未来可以利用这种干细胞作为治疗三度烧伤患者和遗传性皮肤病患者的可替代疗法。

人类胚胎干细胞(Human

embryonic

stem

cells

,hES)有两个基本特征：无限增殖的能力和分化为机体各种细胞的多能性。

57第五十七页，共118页。首先，该课题组获得皮肤干细胞——角质生成细胞(keratinocytes)（角质生成细胞可以使皮肤得到不断更新）；然后研究人员先后分别在体外和生物体体表测试分离出来的角质生成细胞重新形成功能性表皮细胞的能力。

在细胞生物学和药理学方法的支持下，能使hES细胞成功转化为表皮细胞。该课题组研究人员已在体外成功地利用角质生成细胞重建出来一块表皮(epidermis)，最后，他们将获得的表皮移植到免疫能力降低的小鼠上。移植后12周，小鼠移植表皮的局部皮肤区域完全恢复正常。58第五十八页，共118页。59第五十九页，共118页。60第六十页，共118页。61第六十一页，共118页。62第六十二页，共118页。肝癌HepG2细胞株白蚊伊蚊C6细胞成人T淋巴细胞白血病细胞株单核巨噬细胞（活化剂刺激）63第六十三页，共118页。组织工程最先在美国出现。1987年在华盛顿科学基金会上，人们提出组织工程一词。1988年组织工程学被正式确认和定义为：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。五、组织工程的基本概念64第六十四页，共118页。1993年R.Langer和J.Vacant对组织工程概念提出更为简明的定义：应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物。从而使组织工程学研究的内容、应用范围和任务更加明确。组织工程的主要目的或内涵是对人体器官和组织修复。五、组织工程的基本概念65第六十五页，共118页。组织工程的一个独特的方面是研究细胞与可吸收支架材料以及与组织形成有关的环境因素（包括力学负载）的相互作用，细胞对这些相互作用的反应包括细胞增殖和基质的生物合成。组织工程技术的关键在于通过细胞培养使其数量增加，以便于获得足够多的细胞用于体外构建组织，或者将细胞单独置入体内，或者将细胞接种于支架材料后在体内再生组织。五、组织工程的基本概念66第六十六页，共118页。67第六十七页，共118页。68第六十八页，共118页。69第六十九页，共118页。70第七十页，共118页。71第七十一页，共118页。五、组织工程的基本概念72第七十二页，共118页。组织工程的产生外科学的发展目前临床常见的组织器官缺损修复技术主要有以下三种：五、组织工程的基本概念第一、异体组织移植随着科学发展，不仅国外，现在我国同样也能进行多种大的器官，如心、肺、肾和肠等的移植。但在当前器官移植中，仍存在着两个关键的问题：一是所移植的组织或器官的相容性，即来自异体的替代物，易发生免疫反应，终会被排斥掉，难以永久替代受损组织器官的功能；其次是供体来源严重不足。73第七十三页，共118页。第二、自体组织移植这种移植是比较理想的，一般不会引起免疫排斥反应。但为修复病损组织，须以牺牲人体正常组织为代价，结果又形成了供献部位新的组织缺损，是一种以创伤修复创伤的治疗模式。另外自体移植尚存在着潜在的其他影响，这是因为体内各种组织存在着局部调控问题，组织异位可能引起功能紊乱，例如以皮肤代替食管，30年后可能引起皮肤癌；排尿通道异位导入大肠，20~30年后可引起大肠癌。五、组织工程的基本概念74第七十四页，共118页。第三、应用人工合成组织代用品

该类代用品植入体内后，易导致异物反应以及继发感染，而最终被排出体外；金属替代物能引起周围组织萎缩，进而需要采取矫正措施。改善上述医疗技术的追求成为组织工程产生的巨大动力。五、组织工程的基本概念75第七十五页，共118页。巨大需求促发展

当前对组织器官有需求的患者有增无减，如在美国等候组织器官的名单上，平时就有65000人（Vacanti，2000）；按我国人口多于美国5倍粗算，等候者至少也有30万之众，有统计说我国烧伤患者每年达百万之众。从理论上说，人体所有组织器官都可以进行修复和重建。不过现时的组织工程，毕竟仍在发展和完善之中，虽能在相当多的组织器官中应用，效果也很好，但还不能用于所有人体的器官，然而，组织工程的应用趋势已日益广泛，效果越来越理想；组织工程全面应用之日和效果更加完美之时，将不会遥远。五、组织工程的基本概念76第七十六页，共118页。实用性组织工程的最大特点是比其他生物工程更具有实际意义，组织工程的直接目标就是临床应用。五、组织工程的基本概念科学综合的产物20世纪以来所出现的各种工程科学：基因工程、遗传工程、细胞工程以及组织工程等生物工程，都是科学发展的必然。所有学科都有交叉性，组织工程更是如此。77第七十七页，共118页。组织工程作为一种新兴学科具有以下优点：能形成具有生命力的活体组织，对疾病损伤进行形态结构和功能的重建，并进一步达到永久性替代；

可以用最少量的组织细胞（甚至可用组织穿刺的方法获得），经体外培养扩增后，来修复大块的组织缺损，完成无损伤性组织结构和功能的重建；

可按组织、器官缺损情况任意塑型，达到完美的形态修复。

五、组织工程的基本概念78第七十八页，共118页。组织工程的实施需有以下几个基本条件：需要有受者机体所能接受的细胞或组织。需要有支持细胞附着和生长的物质和材料（可取自受者，或人工合成物和陶瓷等）。需要有诱导、调控组织细胞生长增殖和分化调控物质，如生长因子、促血管生长因子等信号转导分子等。五、组织工程的基本概念79第七十九页，共118页。五、组织工程的基本概念80第八十页，共118页。五、组织工程的基本概念组织工程展望一、种子细胞的研究进展1.成体干细胞的可塑性研究2.胚胎干细胞的研究3.人胚胎组织细胞

4.异种细胞的研究

5.种子细胞的扩增及应力与生长的研究

81第八十一页，共118页。二．支架材料的研究进展

支架材料作为组织工程的人工细胞外基质，为细胞的停泊、生长、繁殖、进行新陈代谢和形成新组织提供支持。由于人体组织结构的特殊性，尚难以确定哪几种材料为最佳支持材料。目前研究较多的有以下几种：五、组织工程的基本概念1、可降解高分子材料

2、陶瓷类材料

3、复合材料4、生物衍生材料

82第八十二页，共118页。三、组织构建研究进展

（一）组织工程骨的构建1.单纯构建

2.复合构建3.血管化构建

五、组织工程的基本概念（二）组织工程软骨的构建1.无支架离心管培养

2.软骨细胞与支架材料复合构建3.双层支架构建

83第八十三页，共118页。（三）组织工程肌腱的构建

1.肌腱细胞与复合构建2.应力场三维培养

五、组织工程的基本概念（四）组织工程周围神经的构建

1.在导管中接种雪旺细胞2.雪旺细胞与三维支架复合构建

3.在支架材料上分次接种雪旺细胞4.生物反应器构建

84第八十四页，共118页。（五）组织工程皮肤的构建

1.组织工程表皮

2.组织工程真皮3.表皮-真皮复合构建

五、组织工程的基本概念四、组织工程临床应用

（一）组织工程骨的临床应用（二）组织工程软骨的临床应用（三）组织工程皮肤的临床应用

85第八十五页，共118页。五、组织工程的基本概念组织工程尚需研究的科学问题一、种子细胞的进一步研究（一）细胞来源研究组织工程的种子细胞可有以下来源：自体细胞、同种异体细胞和异种细胞。86第八十六页，共118页。自体细胞五、组织工程的基本概念87第八十七页，共118页。五、组织工程的基本概念88第八十八页，共118页。同种异体细胞

五、组织工程的基本概念89第八十九页，共118页。构建工程化组织需要大量形态、功能均好的种子细胞，多种生物反应器的研究成功及生长因子的应用，已为快速、大量扩增细胞提供了技术平台，但存在以下问题尚需研究。

五、组织工程的基本概念二、细胞培养技术1.快速扩增细胞的形态、功能检测2.生长因子的应用3.细胞生长与应力的关系90第九十页，共118页。三、支架材料的研究四、细胞支架材料的相互作用五、动物体内植入试验六、临床验证研究七、检测及评价八、产业化研究

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