发育毒性和致畸作用公开课课件

第九章发育毒性与致畸作用2023/4/71畸胎学（古代）现代实验畸胎学（十九世纪）发育毒理学（二十世纪）第一节概述2023/4/72Teratology(畸胎学)来自于希腊语monster(怪胎)，即teras(畸胎)。1651年，WilliamHarvey提出发育障碍学说：畸形起因于器官或结构的不完全发育。2023/4/73致畸作用因素电离辐射化学物和药物病毒细菌感染吸烟酗酒母体代谢失调2023/4/75四环素牙2023/4/76先天性水俣病患者2023/4/77反应停(thalidomide)事件孕妇的理想选择？1953年，联邦德国一家名为Chemie

Gruenenthal的制药公司研究人员发现，反应停（沙立度胺）具有一定的镇静安眠作用，而且对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳。1957年10月1日该公司将反应停正式推向市场。2023/4/79当时反应停成了“孕妇的理想选择”，在欧洲、亚洲、非洲和南美洲被医生大量处方给孕妇以治疗妊娠呕吐。科学家们在研制反应停时，并没有料到这种药物会产生如此可怕的副作用。2023/4/710

令人恐怖的副作用到了1960年，欧洲的医生们开始发现，本地区畸形婴儿的出生率明显上升。这些婴儿有的是四肢畸形(主要是双上肢的短肢畸形)，有的是腭裂，有的是盲儿或聋儿，还有的是内脏畸形。2023/4/711发育毒理学(developmentaltoxicology)研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果。2023/4/713第二节发育毒性与致畸性一、基本概念

发育毒性:出生前经父体或（和）母体接触外源性理化因素，引起在子代到达成体之前这段时间内出现的有害作用。

2023/4/714发育毒性具体表现

生长改变：一般指生长迟缓，胚胎与胎儿发育在外来化合物的影响下，较正常的发育过程缓慢。结构异常：由于外来化合物的干扰，胎儿在出生时表现出形态结构异常，即畸形。功能缺陷：胎儿的生理、生化、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。发育生物体死亡：由于外来化合物的作用，在胚胎或胎儿发育期间对胚胎或胎儿产生损害，并致其死亡，具体表现为自然流产、死产，死胎率增加。

2023/4/715变异：指同一种属的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，是小的或次要的改变。一般认为变异不影响正常生理功能，更不危及生命。变异是生命的一种特征，在生物学上具有适应与进化的意义，变异并非畸形，但有时与畸形难于严格区分。一般情况下，变异出现率较低，而且不呈现剂量与效应或反应关系。但是在致畸试验中，如果某种变异出现较多，而且呈现一定剂量效应或反应关系，即使不作为畸形，也应另行记录，并在试验结果评定时，作具体分析。

2023/4/717胚体-胎体毒性➢胚体毒性：通常是指外源性理化因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束的所有的毒性。❑表现为：胚体期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收胎，也偶有死胎。➢胎体毒性：是指器官形成期结束后的因素引发的任何毒性表现。❖包括胎儿死亡、体重降低、骨化迟缓、功能缺陷以及结构异常，甚至肿瘤。2023/4/718在实验动物发育毒性试验中，通常不去区分胎儿与胚体，所以使用胚胎毒性（embryo-fetaltoxicity）更恰当。广义的说胚胎毒性包括孕体结构和功能方面的各种损害，一般情况下，胚胎毒性是指孕体的死亡和生长发育迟缓，而不包括结构畸形。2023/4/719➢不良妊娠结局：妊娠后不能产生外观和功能正常的子代。包括所有的不良结果，如流产、死胎、死产、宫内生长迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等。2023/4/721二、发育毒性作用的特点和影响因素

（一）发育各阶段发育毒性作用的特点

1、着床前期

2、器官形成期

3、胎儿期

4、围生期和出生后的发育期

2023/4/7221、着床前期事件：发生受精、卵裂、进入子宫腔、囊胚形成、原肠胚形成及着床。时间：人类为受精后的第11－12天；啮齿类动物为最初的６天。特点：此期受损的是早期胚胎的相对未分化细胞，可通过代偿性的细胞增生加以修补，不会产生局部缺陷，最多出现发育迟缓，若受损的细胞较多，可造成胚胎死亡，称为着床前丢失。也有例外，如小鼠妊娠第2.5天、3.5天和4.5天用甲基亚硝脲处理可造成子代神经管缺陷和腭裂。这一发育阶段被称为早期不易感期。2023/4/723不同器官敏感期不同，且有交叉重叠。表现为：不同器官致畸高峰时间不同，此期内不同时间给予致畸物会诱发不同器官畸形，同一天染毒可引起多个器官受损。2023/4/725

人类胚胎的致畸敏感期着床前期器官形成期

胎儿期1364521211109873820

中枢神经系统心耳眼上肢下肢唇牙腭致畸敏感度高致畸敏感度低外生殖器2023/4/7262023/4/729此期接触外源性化学物质，主要表现在发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤。围生期接触外源化学物，会严重影响胎儿T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、迁移、归巢及功能，可能暂时甚至永久性地损伤机体的免疫系统。许多化学物质具有发育神经毒性，表现为对感觉、运动、自主和认知等方面的影响。围生期是一生中对致癌物最敏感的时期。4、围生期和出生后的发育期2023/4/730

（二）发育毒性的物种差异

发育阶段致畸效应的特异性：胚胎所处的发育阶段不同，对于致畸作用呈现不同的敏感性。有性生殖动物的着床前胚泡对致死作用较为易感，对致畸作用较差。在胚胎发育后期和新生儿期的发育毒性表现为:生长迟缓、神经、内分泌及免疫系统机能的改变。胎儿对致死作用的易感性较胚胎为低。2023/4/731致畸的物种个体差异：任何环境有害因素的损害效应都存在物种品系及个体差异，在致畸作用中较突出。例如，杀虫剂西维因对豚鼠具有致畸作用，对家免和仓鼠并不致畸。农药敌枯双对大鼠致畸作用明显，但未得到人群调查的证实资料。同一物种不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大，反应停和脱氢皮质酮都有这种现象。2023/4/732可能由于同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异；也可能由于致畸物主要是通过母体胎盘作用于胚胎，而不同物种动物胎盘构造也不相同。这些差异可能是由于遗传因素，即基因型差异。为什么会出现物种及种间差异？2023/4/733（三）发育毒性的剂量反应关系模式：

A.正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在，但较高剂量下几乎引起全窝胚胎死亡。这种类型较常见，此类化学物低剂量下主要导致生长迟缓，随剂量的增加，导致畸形和死胎。多为细胞毒性致畸物，包括烷化剂、抗癌药及很多致突变物。2023/4/734

B.在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸，致畸胎儿常同时出现生长迟缓。当剂量增加到远远超过全窝畸形时才出现胚胎死亡，后者的剂量范围常常与明显的母体毒性剂量范围重叠。这种模式表示受试物有高度致畸作用，较少见，如沙立度胺、糖皮质类固醇等。发育毒性的剂量反应关系模式：2023/4/735

C.只有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生。往往生长迟缓先出现，曲线较平缓，较大剂量时才出现胚胎死亡，其曲线较陡，接近于“全或无”。表明胚胎存活有明显的界限。这类化学物，可被认为是有胚胎毒性（包括胚胎致死性）的，但不具有致畸作用。发育毒性的剂量反应关系模式：2023/4/736三、母体毒性与发育毒性（一）母体因素对发育毒性的影响：

母体毒性：化学毒物对受孕母体产生的损伤作用。表现为增重减慢、功能异常、临床症状、甚至死亡。2023/4/737母体因素对发育毒性的影响1、遗传学：母体的遗传结构是胚胎发育的一个决定因素。如唇腭裂的发病率白种人明显高于黑种人，主要原因在于母体，而非胚胎本身的基因结构。2、疾病：母体受病毒感染、未控制的糖尿病等疾病，将会对胚胎产生影响。如怀孕前三个月，母体高热、病毒感染等均可能导致胎儿中枢神经系统畸形。2023/4/7383、营养：母体蛋白质、热量、维生素、微量元素及酶的辅助因子缺乏将对胚胎产生影响。4、应激：不同形式的母体毒性可能通过诱导生理学应激反应而产生发育毒性。5、对胎盘的毒性：胎盘是母体和胚胎进行物质交换的结构，为胚胎提供营养、气体交换、废物排出。胎盘可产生维持妊娠关键的激素，而且能代谢和储存外源化学物。外源化学物既可透过胎盘进入胎儿体内，同时胎盘也可能是其作用靶点，或作为其储存库。2023/4/739（二）母体毒性与胚胎毒性的关系

1、具有胚胎毒性，但无母体毒性2、既有胚胎毒性，也有母体毒性3、具有母体毒性，但不具有胚胎毒性4、既无母体毒性，也无胚胎毒性（一定剂量范围内）2023/4/740

四、父源性发育毒性父源性出生缺陷（paternalbirthdefect）影响因素：遗传缺陷、年龄因素和外界暴露因素。父源性暴露引起子代发育异常包括：流产、死胎、低出生体重、畸形、功能障碍等。2023/4/741第三节致畸（发育毒性）作用机制2023/4/742

1、不发育(agenesis)

由于某些重要的原基组织(primordialtissue)不存在或缺乏邻近组织或前体组织的正常诱导而使原基组织不发生，结果某个器官或躯体部分发生或完全缺失。

2、发育不全(hypoplasia)

这种畸形常在名词前冠以“小”字，如小头、小眼等。此外，亦有软骨发育不全等。

3、发育受阻某器官或结构发育至半途时受阻而停止，可分为四类：①不合并(non-fusion）；②不分裂(non-division）③抑制迁移(sup-pressedmigration）；④暂时性结构的保存(persistenceoftransitorystructure），如肛门闭锁等。原基：个体发生中发育成机体特定器官的胚胎区先天畸形的发生方式2023/4/743

4、相邻原基粘连如马蹄肾，或原基分裂如分裂输尿管。

5、生长过度（overgrowth）如多指、巨指或先天性角化过度等。

6、错位（misplacement）如内脏错位等。

7、错误迁移（incorrectmigration）如卵巢迁移到外生殖器，并耳等。

8、不典型分化(atypicaldifferentiation）包括先天性肿瘤的形成、异位和分化。

9、返祖（atavism）常见的有多毛、复乳等。2023/4/744

畸形的引发机制1、基因突变与染色体畸变2、干扰基因表达3、细胞损伤与死亡4、细胞凋亡5、干扰细胞间的交互作用6、通过胎盘毒性引起发育毒性7、干扰母体稳态8、内分泌干扰作用2023/4/745第四节发育毒性和致畸试验与评价

外源化学物发育毒性的评价需要四方面的资料：

①环境流行病学资料②控制下的临床研究资料③动物发育毒性试验资料④体外试验资料

作为一个新产品的登记与审批，主要根据前三类资料。在前三类资料中，首先是动物实验资料，因为大多数情况下新产品在上市前，还没有流行病学资料和控制下的临床资料。2023/4/746一、动物发育毒性试验

优点：容易控制接触条件，控制接触动物的数量、年龄、状态以及选择检测效应指标（终点）。

缺点：动物实验结果外推到人具有不确定性。2023/4/7471、动物选择致畸试验中动物应选择：食性和对受试物代谢过程与人类接近，易饲养、易繁殖和价廉之外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多以及胎盘构造与人类接近的动物。致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外为小鼠或家兔。2023/4/748大鼠受孕率高，易于得到足够标本数，且大鼠对大多数外源化学物代谢过程、基本与人类近似。但不足之处是大鼠对一般外源化学物代谢速度很高，对致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性结果。小鼠自然畸形发生率较大鼠高。对形成腭裂的致畸物更较为敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，自然发生率也较高。鸡胚也可进行致畸试验，可同时得到大量鸡胚，胚胎发育条件也较易控制。但鸡胚不是哺乳动物，缺乏受试物与母体的相互作用。2023/4/7492、剂量分组致畸试验一般应先进行预试验，找出引起母体中毒的剂量。一般用孕鼠8～10只，在妊娠5～16天内给予受试物。如出现较严重的母体中毒、流产或胚胎大量死亡，将剂量略为降低，直到找出引起母体轻度中毒一般症状的剂量。根据预试结果进一步确定正式试验剂量。2023/4/750正式试验最少应设3个剂量组，另设对照组。

高剂量组——该剂量一般不超过LD50的1/5-1/3，应引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%；

低剂量组——可以为LD50的1/100-l/30，不应观察到任何中毒症状；

中剂量组——可以允许母体出现某些极轻微中毒症状，其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。2023/4/751如果已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。最高剂量组能引起母体轻度中毒，仍未观察到致畸作用，则可确认为该因素不具有致畸作用。2023/4/7523、动物交配处理将性成熟雌雄动物按雌雄1:1或2:1的比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涤片精子检查，出现阴栓或精子之日即为受孕“0”日，也有人作为第l日。2023/4/753

接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致。大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始接触受试物，每日一次，持续到第15天。如研究器官易感性，则应在上述期间增加动物组数，将受试物每日分别给予不同组的动物，根据畸形出现的情况，确定受试物的敏感时间和靶器官。2023/4/754试验期间每天称取母鼠体重。根据体重增长，随时调整剂量，观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重持续增长，表示妊娠过程及胚胎发育正常。

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4、胎仔检查

自然分娩前1～2日将受孕动物处死剖腹，取出子宫及活产胎仔，记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家免在第29天。胎仔在临近出生期间，发育进展极为迅速。相差半日，发育情况即有显著差异，骨骼发育尤为显著。2023/4/756孕鼠处死后，从子宫顶端依次取出其中活产幼仔、死胎以及吸收胎，并记录编号。大鼠和家免还应取出卵巢，记录黄体数用来代表排卵数。黄体为排卵后由卵泡迅速转变成的富有血管的腺体样结构。活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后进行畸形检查。为保证哺乳机会，一般主张每窝保留8只幼仔，并尽量雌雄数量相等。2023/4/757畸形检查①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损等。2023/4/758动物试验的缺点：1、动物实验结果外推到人的不肯定性：由于致畸作用存在种属差异和品系差异，故对一种受试物须多次重复同一实验，均出现一定畸胎发生率，才能认为畸胎发生与该受试物有关。至少应能在两种以上实验动物的实验中都显示肯定能够的致畸作用才能可靠的推导于人。但只要受试物在一种动物具有致畸作用，就应警惕它对人类具有的潜在危险性。

2023/4/7592、动物高剂量接触与人类实际低剂量接触的区别

阿司匹林和磺胺类药物对大鼠有致畸作用，但这些药物人类已长期使用，并未发现肯定的致畸作用，可能是人所利用的剂量未达到可引发致畸的程度。维生素A常用作致畸的阳性对照物，给大鼠1000mg/kg剂量可引发畸胎，按此剂量推算，50kg体重的人每天应服用50ml的鱼肝油，才会产生致畸作用，而人类很难摄取如此大量的鱼肝油，故到目前为止，维生素A并未被列为人类的致畸物。一定要考虑人类的实际接触剂量。此外更要重视流行病学的调查，设法收集接触者的流行病学及临床资料，只有将动物实验结果与流行病学调查资料结合起来，进行综合分析，才能得出正确的结论。2023/4/760对大多数化学物质来说，三段生殖毒性试验设计通常是最适当的，关键因素是各个生殖阶段之间不得有间隔，即在三个有关联的阶段接触受试物的时期至少有一天的重叠，并能直接或间接地评价生殖过程的所有阶段。2023/4/761生殖发育过程可分为6个阶段A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育与成熟、交配行为、受精。B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、胚体发育、主要器官形成。2023/4/762D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胚体的发育与生长、器官的发育与生长。E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长，对独立生活的适应、达到完全的性功能。2023/4/763三段生殖毒性试验生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）胚体-胎体毒性试验(致畸试验)出生前后发育毒性试验(围生期毒性试验)2023/4/764三段生殖试验图解

Ⅰ.生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）

Ⅱ.胚体-胎体毒性试验（致畸试验）

Ⅲ.出生前后发育毒性试验（围产期毒性试验）2023/4/765二、人群流行病学研究

（一）人类证据的获得流行病学调查：在接触外来化合物的人群中进行调查。调查的观察指标可参照有关的临床诊断检验指标，还可进行染色体畸变检查。2023/4/766（二）发育毒性资料的使用1、化学物致畸潜力分类和安全系数确定2、ICH人类用药危险度分类3、根据动物试验人群调查资料对致畸物分级4、确认人类致畸物的标准2023/4/767三、发育毒性的替代试验（一）体外预筛试验

1、大鼠全胚胎培养

2、器官培养

3、胚胎细胞微团培养

4、小鼠胚胎干细胞试验2023/4/768（二）体内预筛试验（C.K试验）又名生殖／发育毒性筛选试验依据：大多数出生前受到的损伤将在出生后表现为存活力下降和／或生长障碍。因此在仔鼠出生后，观察其外观畸形，胚胎致死，生长迟缓等发育毒性表现，而不进行传统常规试验中内脏和骨骼的检查，就可达到筛选的目的。优点：所用动物少，检测终点少，实验周期短，能提供有关化学物对生殖和／或发育可能发生影响的初步信息。2023/4/7691、化学物致畸潜力分类和安全系数确定

根据动物试验中发育毒性效应的类型、严重性和发生率将化学物分为四类，并规定各类型的不同的安全系数范围，用以评定待测物发育毒性的危险度。2023/4/770国际生命科学院(InternationalLifeSciencesInstitute,ILSI)1989年提出

2023/4/7712、ICH人类用药危险度分类:

ICH：人用药品注册技术要求国际协调会。

ICH在研究设计中规定：被批准的新药要根据动物发育毒性的研究结果和从人类使用经验得到的信息，将该药品在妊娠用药类别中定位，并要求医生在开处方时遵守，以使怀孕妇女按规定使用这些药品。2023/4/772A、B、C2：仅在如果明显地需要时，在怀孕期间可使用。C1：仅在如果证明可能的效益与对胎儿的可能的危险比较是可取时，在怀孕期间可使用。D：如果在怀孕期间使用，应通知病人对胎儿可能的危害。X：在怀孕或可能怀孕的妇女中禁止使用。2023/4/7733、根据动物试验人群调查资料对致畸物分级根据欧共体（EEC）和经济与发展组织（OECD）建议

2023/4/7744、确认人类致畸物的标准(1)一种特殊的缺陷或几种缺陷并发(综合征)频率突然增加。(2)缺陷的增加与某种已知的环境改变相交联，如一种新药的广泛使用巧合。(3)已知在妊娠的特殊阶段暴露于接触环境的改变，产生有特征性缺陷的综合征。(4)缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿产生的其他共同的因子。

2023/4/775已知的人类致畸物电离辐射：放射治疗、放射性碘、原子武器感染：风疹、巨细胞病毒、单纯性疱疹、梅毒、弓形体病毒代谢失调：克汀病、糖尿病、苯丙酮酸尿、男性化肿瘤、高温药物和化学品：反应停、Abameetin、酒精、氨基蝶呤、雄性激素、麻醉剂、抗甲状腺药物、白消安、咖啡因、氯代联苯类、香豆素抗凝剂、环磷酰胺、二已基乙烯雌酚、敌螨普、三氟氯溴乙烷、异维A酸、锂、甲巯咪唑、有机汞化合物、有机溶剂类、苯妥因、腐霉利、四环素、三甲恶唑烷二酮、丙(基)戊酸2023/4/7761、生育力和早期胚胎发育毒性试验

（一般生殖毒性试验）

研究目的：评价化学毒物对配子发生和成熟、交配行为、生育力、胚体着床前和着床的影响。实验动物：至少一种，首选大鼠。每组雌雄各16～20只（窝）。给药时间：交配前雄性4周，雌性2周，交配期（2～3周），雌性着床前（大鼠孕6天）。终末处理：雄性证实交配并使雌性受孕成功后处死，雌性在受孕13～15天终止妊娠。2023/4/777观察指标雄性：饮水量、摄食量、体重变化、睾丸、附睾重量及脏器系数、附睾精子计数、活动度和形态观察、生育率、睾丸附睾病理组织学检查；雌性：饮水量、摄食量、体重变化、一般健康状况及死亡数、交配行为、受孕率、卵巢和子宫组织学检查；孕鼠：妊娠体重变化，处死后检查黄体数、着床数、吸收胎、死胎和活胎数。结果评定：F0代和F1代毒性及