蛋白质结构公开课课件

蛋白质结构1（二）蛋白质的空间结构（三维结构）1.蛋白质空间结构的研究方法

(1)X-射线衍射法（X-raydiffractionmethod）(2)核磁共振（NMR）(3)光谱法（红外光谱、紫外差光谱、荧光光谱）(4)旋光色散法（opticalrotatorydispersion,ORD）(5)园二色性（circulardichroism,CD）(6)氢同位素交换法2X-射线衍射法简单原理3早在20世纪30年代，Pauling和Corey就开始有X-射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构，他们得到了重要的结论:(1)肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋转。

(2)肽键中的四个原子和它相邻的两个α-碳原子处于同一平面，形成了酰胺平面，也称肽键平面。(3)在酰胺平面中C=0与N-H呈反式。

56多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。而Cα-C键和Cα-N键是单键，可以自由旋转，其中Cα-C键旋转的角度称ψ，Cα-N键旋转的角度称φ。ψ和φ这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。7①蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100º。

②在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。

③α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。

α-螺旋结构的要点如下：

α-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。9除了上面这种典型的α-螺旋外，还有一些不典型的α-螺旋，所以规定了有关螺旋的写法，用“nS”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸的残基数。S为氢键封闭环内的原子数，典型的α-螺旋用3.613表示，非典型的α-螺旋有3.010，4.416（π螺旋）等。1011(2)β-折叠也是pauling等人提出来的，它是与α-螺旋完全不同的一种结构。①β-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。②在两条相邻的肽链之间形成氢链。13③β-折叠有平行和反平行的两种形式:④每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm。14(3)β-转角

(β-turn)β-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180º的回折，在回折角上的结构就称β-转角，也称发夹结构，或称U形转折。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N—H之间形成氢键。15(5)Ω环这是最近发现普通存在于球状蛋白质中的一种新的二级结构，这种结构的形状象希腊字Ω，所以称Ω环。Ω环这种结构总是出现在蛋白质分子的表面，而且以亲水残基为主，这种结构与生物功能有关，另外在分子识别中可能起重要作用。173.蛋白质的超二级结构和结构域

超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是指二级结构的基本结构单位（α-螺旋，β-折叠等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。已知的超二级结构主要有αα，βxβ，β-曲折和β-折叠筒等。18αα：是两个α-螺旋互相缠绕，形成一个左手超螺旋。19如χ为β-折叠，则为βββ。如x为无规卷曲，则为βcβ。21β-曲折（β-meander）：是三条或三条以上反平行的β-折叠通过短链，如β-转角相连。22β-折叠筒（β-sheatbarrel）：由多条β-折叠链所构成的β-折叠片，再卷成一个园筒状的结构。23

结构域是1970年Edelman提出的，它是指在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。

最常见的结构域约含100～200个氨基酸残基，少至40个左右，多至400个以上。

结构域是球状蛋白质的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域的缔合。25对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由2个或更多个结构域组成。26下面以鲸肌红蛋白为例，说明蛋白质的三级结构，1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。29肌红蛋白是由一条多肽链折叠盘绕成近似球状的构象。(2)主链的80%左右是右手螺旋，其余为无规卷曲，一条多肽链共有8个螺旋区（A、B、C、D、E、F、G、H），7个非螺旋区（二个在末端，中间有五个）。(3)氨基酸残基的亲水基团几乎全部分布在分子的表面，而疏水基团几乎全部在分子的内部。(4)血红素辅基垂直地伸出分子表面，通过一个His残基和分子内部相连。30从目前对球状蛋白质二、三级结构研究的资料来看，它们有一些共同的特点：(1)在球状蛋白质分子中,一条多肽链往往通过一部分α-螺旋，一部分β-折叠，一部分β-转角和无规卷曲等使肽链折叠盘绕成近似球状的构象。(2)球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形成亲水面，而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成疏水核。(3)球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴，空穴周围有许多疏水侧链，是疏水区，这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质的功能部位。315.蛋白质的四级结构

四级结构是指蛋白质的亚基聚合成大分子蛋白质的方式（亚基是指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位）。亚基与肽链32一般来说亚基不具有生物活性，即使有也很小，只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后，才具有生物活性。33血红蛋白四级结构的确定要归功于英国科学家Max.Perutz34下面以血红蛋白（hemoglobin）为例，说明蛋白质的四级结构，血红蛋白是由四个亚基组成，2个α-亚基，2个β-亚基，每个亚基由一条多肽链与一个血红素辅基组成。４个亚基以正四面体的方式排列，彼此之间以非共价键相连（主要是离子键、氢键）

。356．纤维状蛋白质的构象

（1）角蛋白（keratin）α-角蛋白36（2）丝心蛋白（也称丝蛋白，fibroin）37（3）胶原蛋白（collagen）387.维持蛋白质构象的化学键

维持蛋白质构象的化学键氢键、离子键、疏水键、范德华引力二硫键、配位键39

疏水键二硫键氢键离子键范德华引力配位键40a离子键b氢键c疏水键d范德华引力41六、蛋白质的理化性质

蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似，但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物，也就出现了一些新的性质。42（一）胶体性质

由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。43（二）酸碱性质和等电点1.蛋白质分子的可解离基团2.等电点在某一pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的pH值就是蛋白质的等电点。

44每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。453.等离子点

等离子点是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，蛋白质所带净电荷为零时的溶液的pH值。等离子点是一个常数。464．蛋白质等电点的测定等电聚焦47（三）电泳移动的速度v=E·Zf48(四)变性作用（denaturation）

1．变性的概念和理论概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。理论：吴宪提出肽链从紧密有序结构→松散无序的结构492．变性的因素物理因素:加热、紫外线、X-射线、超声波等。化学因素:酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。503．变性蛋白质的特性（1）生物活性全部或部分丧失（2）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加（3）一些物理化学性质的改变（4）生化性质的改变514．变性的可逆性52蛋白质的一级结构决定高级结构53（五）凝固作用变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。54（六）沉淀作用

1．加酸沉淀蛋白质2．加中性盐沉淀蛋白质3．加有机溶剂沉淀蛋白质4．加重金属盐沉淀蛋白质5．加生物碱试剂沉淀蛋白质55（七）沉降作用

什么是沉降？沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。t：时间（sec）x：下沉的距离（cm）v=dxdt沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单位离心场中的沉降速度。s：沉降常数v：沉降速度（cm/sec）w：离心机转头的角速度（弧度/sec）x：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，以cm计。瑞典的蛋白质化学家T.Svedberg1S=10-13秒。56（一）蛋白质一级结构与功能的关系

1．镰刀状红细胞贫血病（sickle-cellanemia）七、蛋白质结构与功能的关系

5758ObservedNormalrangeRedcellcount2.6×106/ml4.6～6.2×106/mlHemoglobincontent8g/100ml14～18g/100mlWhitecellcount15,250/ml4,000～10,000/ml59HbA（adulthemoglobin）HbS（sickle-cellhemoglobin）

601954年 指纹图谱（fingerprint）6162HbAβ-链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…HbSβ-链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…636465662．激素和它的前体分子胰岛素和它的前体676869

（二）蛋白质的空间结构与功能的关系以血红蛋白的别构效应为例说明蛋白质的空间结构与功能的关系701．血红蛋白中血红素辅基的结构712．血红素中的Fe2+与氧结合前后价数不变723．血红蛋白与氧的结合734．血红蛋白的别构效应(变构效应)（allostericeffect）7475氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态→R态）T态（tensestate）紧张态 R态（relaxedstate）松驰态。76血红蛋白是由两个α-亚基和两个β-亚基组成的四聚体（α2β2），有稳定的四级结构，与氧的亲和力很弱，但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后。即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。77别构效应是指含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化。785．波耳（Bohr）效应H+和CO2促进HbO2释放O2

79806.2，3一二磷酸甘油酸对Hb氧合的影响Or2,3-Bisphosphoglycerate(BPG)818283八、蛋白质的分离、纯化和鉴定一般包括五步（一）细胞破碎

有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。84（二）抽提

根据蛋白质的溶解性用适当溶剂来抽提，总的原则是要制备的蛋白质溶在什么溶剂中就用什么溶剂来抽提。85（三）分离

1．盐析法在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、NH4Cl等。

862．有机溶剂沉淀法常用的是乙醇、丙酮。873．等电点沉淀利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，可以调溶液的pH，尽量接近它的等电

点，而使蛋白质沉淀。884．吸附法吸附法是利用各种吸附剂和蛋白质结合能力（吸附能力）的不同来分离蛋白质。895．透析和超滤超滤法是最近几年发展起来的一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白质。透析90（四）纯化1．离子交换层析离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（CM-C），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）。91922．凝胶过滤也称分子排阻层析、分子筛层析，这是