第3章蛋白质的分离

第一节蛋白质分离纯化概述

一、蛋白质分离纯化的一般程序二、蛋白质纯化方法分类

三、蛋白质分离纯化中的注意事项

回总目录1HubeiUniversity现在是1页\一共有180页\编辑于星期四一、蛋白质分离纯化的一般程序2HubeiUniversity现在是2页\一共有180页\编辑于星期四对于任何一个特定的蛋白质，纯化方案细节的确定都有赖于一系列的因素，，这些因素包括：1.正确选择原材料和定位目的蛋白（胞内或胞外）；2.目的蛋白的表达水平；3.蛋白质的理化性质；4.纯化的目的。3HubeiUniversity现在是3页\一共有180页\编辑于星期四一、蛋白质分离纯化的一般程序0.材料选取1.破碎生物组织，用缓冲液将蛋白质抽提出来；对于外泌型蛋白，省去破碎步骤2.用离心法将亚细胞成分及细胞碎片与溶液分开。3.应用盐析法或有机溶剂法将蛋白质沉淀下来4.应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开5.使蛋白质结晶或制成冻干粉

回第一节4HubeiUniversity现在是4页\一共有180页\编辑于星期四二、蛋白质纯化方法分类沉淀法：利用一种蛋白质相对于其它蛋白质溶解度的不同来进行（同一溶剂）2.

相分配法：依据蛋白质在两相间分配作用的不同来进行（不同溶剂）3.

柱层析法：利用蛋白质对固体载体的吸附性质不同，通过柱层析方式将它们分别洗脱下来。包括：亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。4.电泳法及离心法：依据蛋白质在电场或离心场中运动速度的不同来进行。5HubeiUniversity现在是5页\一共有180页\编辑于星期四■

各种纯化或分析方法的原理：硫酸铵

沉淀分离细胞细胞器分离细胞质匀浆大分子核酸多醣(脂类)分子大小不同分子电荷不同分子极性不同亲和力不同小分子细胞碎片Celldebris蛋白质氨基酸

单糖核酸

脂肪酸凝胶过滤,SDS,超滤,离心离子交换,等电聚焦反向层析,盐析亲和层析,羟基磷灰石6HubeiUniversity现在是6页\一共有180页\编辑于星期四■

各种纯化方法的应用次序：102030405123467沉淀离子交換亲和层析凝胶过滤步骤次数匀浆回第一节7HubeiUniversity现在是7页\一共有180页\编辑于星期四三、蛋白质分离纯化中的注意事项：

1.首先要建立一个方便灵敏的分析方法。2.要选择一种最好的含有目的蛋白质的材料3.分离步骤要尽可能少4.尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性：包括六个方面8HubeiUniversity现在是8页\一共有180页\编辑于星期四尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性

▼分离过程快速，保持在低温（4℃）下进行。▼尽量避免过度暴露于空气中▼注意重金属离子污染▼避免极端的pH及温度对蛋白活性的影响▼维持较高的提取液浓度▲少数蛋白质需在高离子强度的极性介质中保持活性，需要向提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO4

等回第一节9HubeiUniversity现在是9页\一共有180页\编辑于星期四第二节材料的选择与处理一、材料的选择二、材料的处理三、细胞破碎方法四、初级纯化五、膜蛋白的释放

六、胞外酶的分离回总目录10HubeiUniversity现在是10页\一共有180页\编辑于星期四一、材料的选择

先考虑以下几点： 5W

a.

要纯化那一个蛋白？

What?

b.

为何要纯化此蛋白？

Why?

c.

由何种材料纯化？

Where,from?

d.

由那一个生长期？

When?

e.

如何纯化此蛋白？

How?11HubeiUniversity现在是11页\一共有180页\编辑于星期四■

目标材料的选择：

何种生物来源？

动物、植物、微生物

何种组织？

根茎叶花果实种子或动物某器官

何种细胞器？

细胞核、液泡、叶绿体

细胞内、外？

分离方法选择

水溶性或脂溶性？

影响抽取策略的设计12HubeiUniversity现在是12页\一共有180页\编辑于星期四SP蛋白质表現(马铃薯各组织)SPRNA表現(马铃薯各组织)StPierre,B.;Bertrand,C.;Camirand,A.;Cappadocia,M.;Brisson,N.(1996)PlantMolecularBiology30:1087-1098Thestarchphosphorylasegeneissubjectedtodifferentmodesofregulationinstarch-containingtissuesofpotatoL:leaf（叶）P:petiole（叶柄）S:shoot（枝条）St:stem（树干）T:tuber（块茎）R:root（根）SP:

starchphosphorylase13HubeiUniversity现在是13页\一共有180页\编辑于星期四材料的选择原则：

（1）材料中目的蛋白质含量要高（2）材料容易获得。回第二节14HubeiUniversity现在是14页\一共有180页\编辑于星期四二、材料的处理1.动物材料2.植物材料3.微生物材料回第二节15HubeiUniversity现在是15页\一共有180页\编辑于星期四1.动物材料的处理最重要的是在接近动物正常生理状态下取出组织和器官，把死亡后的变化控制在最小限度内（肾移植）取材料后迅速处理，或立即置入液体氮中速冻，再转置低温(-10℃～-50℃)下保存备用。返回16HubeiUniversity现在是16页\一共有180页\编辑于星期四2.植物材料的处理

使用植物材料时，除了上述的注意事项外，还要注意：（1）

植物细胞壁比较坚厚，含有大量的纤维素，要采取有效的方法充分破碎（纤维素酶、研磨）。（2）

植物组织中含有大量多酚、丹宁、类黄酮等次生物质，在提取过程中会被氧化成褐色产物、干扰蛋白质的进一步纯化，必须防止（加保护剂防止氧化，如：Vc、Bβ-mercaptoethanol；加沉淀剂使其沉淀，如PVP聚乙烯吡咯烷酮）。（3）植物细胞的液泡内含物有可能改变抽提液的pH值（破碎细胞时会释放出来），因此，对植物组织常使用较高浓度的缓冲液作为提取液。

17HubeiUniversity现在是17页\一共有180页\编辑于星期四■

植物色素的产生及去除：

Phenoliccompound

→→→

褐色色素

PolyphenoloxidaseBβ-mercaptoethanol低溫抑

制降低催化adsorb吸附Polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)聚乙烯吡咯烷酮返回18HubeiUniversity现在是18页\一共有180页\编辑于星期四3.微生物材料的处理微生物可大规模培养，原料来源一般不受限制通过基因工程技术，将基因转化到微生物中，可以大量表达蛋白质，对稀有珍贵蛋白质的获得有重要的实际意义。

返回19HubeiUniversity现在是19页\一共有180页\编辑于星期四三、细胞破碎方法大多数蛋白质结合于细胞器上，将细胞破碎才能释放破碎的方法有两种分类法：从破碎细胞的原理上可分为化学法、物理法和机械法；从破碎细胞的力量及对细胞的伤害方面，可分为温和的方法、剧烈的方法和较剧烈的方法20HubeiUniversity现在是20页\一共有180页\编辑于星期四1机械破碎

手动或马达驱动的匀浆器韦林氏捣切器研钵21HubeiUniversity现在是21页\一共有180页\编辑于星期四2物理破碎

超声探头压力差破碎机(N2CO23Mpa)(20kHz100-150W0-10oC3-10min)冻融破碎法22HubeiUniversity现在是22页\一共有180页\编辑于星期四3.化学破碎法

有机溶剂处理

甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等表面活性剂处理非离子型:TritonTween

离子型表面活性剂破细胞效果虽好,但容易引起蛋白失活,因此通常不用。23HubeiUniversity现在是23页\一共有180页\编辑于星期四4酶学破碎法

溶菌酶(专一作用于肽多糖-1,4糖苷键)革兰氏阳性细菌 +溶菌酶革兰氏阴性细菌 +溶菌酶酵母(胞壁主要为-1,3-葡聚糖) +-葡聚糖酶、蜗牛酶霉菌(胞壁含有几丁质) 几丁质酶植物细胞 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶在一定的温度、PH、离子强度等条件下,保温一定时间让细胞自溶。24HubeiUniversity现在是24页\一共有180页\编辑于星期四■

细胞打破之后：(1)

降低溫度(2)

尽快纯化(3)

避免氧化(4)

避免吸附(5)

避免污染回第二节25HubeiUniversity现在是25页\一共有180页\编辑于星期四四、初级纯化26HubeiUniversity现在是26页\一共有180页\编辑于星期四1.抽提(在一定条件下,用适当的溶剂处理粗提液,让蛋白充分溶样到溶剂中的过程)注意事项:温度(0-10oC) PH(偏离酶蛋白pI)

抽提液的体积(3-5倍) 添加保护剂27HubeiUniversity现在是27页\一共有180页\编辑于星期四抽提蛋白质过程中所要注意的问题

球蛋白一般用一定盐浓度的缓冲液进行抽提脂蛋白（油性）一般用稀释的去垢剂（如SDS）或有机溶剂来抽提抽提植物中的蛋白质（尤其是酶）要特别注意提取液的pH和缓冲能力（因为液泡内含物的释放）防止酚类物质的氧化，干扰蛋白质的分离提纯向提取buffer中加入抗氧化剂：巯基乙醇、Vc（抗坏血酸）、DTT（二硫苏糖醇），易与氧化酶反应，阻止酚类和Cys的氧化；加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮），可以吸附醌类物质而沉淀，被离心除掉）28HubeiUniversity现在是28页\一共有180页\编辑于星期四5.提取缓冲液的体积一般V/G=2～5之间。不宜过大，会使得以后分离、纯化、浓缩的流程时间增长，又增加损失率，6.抽提的原则是“少量多次”，即对于等量的溶液，分多次抽提比一次抽提好得多7.要防止蛋白水解酶的作用。可以向溶液中加入二异丙基氟磷酸（DFP）或碘乙酸或苯甲基磺酰氟化物（PMSF）

29HubeiUniversity现在是29页\一共有180页\编辑于星期四原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子）有不同的质量（mass）或密度（density），因此在离心场中有不同沉降速率。

不同的蛋白质分子量差别很大，密度差别很小（不超过15%）。蛋白质的平均密度是1.37g/cm3。

结合蛋白密度差异较大。离心力由转子中心到蛋白质界面的距离来决定。2.离心分离（centrifugation）现在是30页\一共有180页\编辑于星期四

离心（centrifugation）

沉降系数（sedimentationconstant）：每单位离心场的速度（S）。与蛋白质的密度和形状有关，也与介质的密度和粘度有关。离心可用于两个方面：作为分离技术：从混合物中分离一种成分；作为分析技术：测定物质的物理性质，如分子量，密度，形状及平衡结合常数（equilibriumbindingconstants）。现在是31页\一共有180页\编辑于星期四

低速离心(<8000rpm或构对离心力(RCF)<1104g)

高速离心(1104-2.5104rpm或RCF=1104-105g)差速离心:采用不同的离心速度和离心时间,使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。类型32HubeiUniversity现在是32页\一共有180页\编辑于星期四Recoverpellet33HubeiUniversity现在是33页\一共有180页\编辑于星期四34HubeiUniversity现在是34页\一共有180页\编辑于星期四

速率区带离心

（rate-zonalcentrifugation）

用蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度；高速离心机（~40,000r/min）；离心后，被分离的物质分布在相应的密度区带内；注意：控制时间。太短，达不到充分分离；太长，分离物沉淀到离心管底部。现在是35页\一共有180页\编辑于星期四

不能精确测定分子量，因为蛋白质的形状差异也影响沉降率；一次分离多种不同类型聚合物或颗粒的最有效方法平衡密度梯度离心（equilibriumdensity-gradiententrifugation）：用于分离DNA和细胞器

速率区带离心（rate-zonalcentrifugation）现在是36页\一共有180页\编辑于星期四3.过滤分离借助各种过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离开来的技术。常用介质:

滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。常用方法:

粗滤(2m)、微滤(0.2-2m)、超滤(20Å-0.2m)、反渗透(<20Å)和透析等。回第二节37HubeiUniversity现在是37页\一共有180页\编辑于星期四五、膜蛋白的释放

膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器（线粒体、叶绿体、内质网或核等）的膜上。按其所在位置大体可分为外周蛋白和固有蛋白（膜内蛋白）两种类型

38HubeiUniversity现在是38页\一共有180页\编辑于星期四■

细胞膜蛋白质抽取较困难：●

抽取膜蛋白时须添加

TritonX等表面活性剂极性非极性Buchananetal(2000)BiochemistryandMolecularBiologyofPlantsp.839HubeiUniversity现在是39页\一共有180页\编辑于星期四外周蛋白通过次级键和外膜脂质的极性头部螫合在一起，可以用含乙二胺四乙酸（EDTA）的适当缓冲液将其抽提出来。外周蛋白被抽提后，膜一般仍保持完整的双层结构。固有蛋白嵌合在双层中。抽提固有蛋白时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要仍保持疏水基暴露在外的天然状态，这个过程称为增溶作用

40HubeiUniversity现在是40页\一共有180页\编辑于星期四理想的增溶剂（去污剂）既有亲水部分也有疏水部分，当浓度较高时能形成胶团，内部为疏水核，外部为亲水层。增溶时，膜蛋白疏水部分嵌入胶团的疏水核中而与膜脱离，同时保住了膜蛋白的疏水结构。被增溶出来的膜蛋白通过透析等方法除掉去污剂，再进一步纯化。41HubeiUniversity现在是41页\一共有180页\编辑于星期四用于增溶过程中的去污剂按结构可分为四种：阴离子去污剂（脱氧胆酸盐）阳离子去污剂（溴化十二烷基三甲铵）两性离子去污剂（二甲基十二烷基甘氨酸）非离子型去污剂（TritonX－100、辛基葡萄糖苷）。近年，非离子型去污剂辛基葡萄糖苷应用广泛，因为它的临界胶团浓度高（达25mmol／L），同时易于透析，也有利于膜蛋白的重组。

42HubeiUniversity现在是42页\一共有180页\编辑于星期四几种去污剂去污剂包括两类：

非离子型（nonionicdetergents）如TritonX-100、辛基葡萄糖

离子型（ionicdetergents）如脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸纳现在是43页\一共有180页\编辑于星期四低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）.微团很小、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分向内。

临界微团浓度（criticalmicelleconcentration，CMC）：去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数现在是44页\一共有180页\编辑于星期四离子型去污剂除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键,使蛋白质变性。非离子型去污剂在不同的浓度有不同的作用方式浓度较高（>CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团.

浓度较低（<CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用.现在是45页\一共有180页\编辑于星期四大部分膜周边蛋白（peripheralprotein）通过离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如Ca2+）结合的试剂进行分离。现在是46页\一共有180页\编辑于星期四释放膜蛋白还有其它的方法，如：（l）用磷酸脂酶A消化；（2）在高pH和高温下进行超声作用；（3）在低温（－20℃）下，用丙酮抽提，所得干粉可长期贮存。这是一种经典的现在仍在使用的方法回第二节47HubeiUniversity现在是47页\一共有180页\编辑于星期四六胞外酶的分离

◆胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的可通过离心或过滤将菌体除去、上清液经浓缩（超滤法）再进一步纯化。回第二节48HubeiUniversity现在是48页\一共有180页\编辑于星期四第三节蛋白质的初步提纯（粗分级）一、去除核酸二、沉淀法去除杂蛋白三、蛋白质的脱盐和浓缩

回总目录49HubeiUniversity现在是49页\一共有180页\编辑于星期四一、去除核酸核酸沉淀剂法：常用的核酸沉淀剂有：MnCl2

、硫酸鱼精蛋白、链霉素等。核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶的应用：

一般将酶与抽提液一起（4℃）培养30–60分钟，就可以把DNA或RNA降解成足够小的碎片，而不影响蛋白质的分离。回第三节50HubeiUniversity现在是50页\一共有180页\编辑于星期四二杂蛋白的去除

主要方法：1.盐析法2.有机溶剂沉淀法(甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等)

3.有机聚合物沉淀法(单宁、聚丙烯酸等)

4.选择性变性沉淀法5.等电点沉淀法

回第三节原理：（1）破坏蛋白质分子的水合作用，降低蛋白质在水溶液中的溶解度，而使其沉淀；（2）降低蛋白质分子之间的同性相斥的作用，也能降低蛋白质的溶解度，而使其易于沉淀51HubeiUniversity现在是51页\一共有180页\编辑于星期四1.盐析法1）盐溶与盐析2）盐析法沉淀蛋白质的具体操作3）改良的硫铵分级法4）盐析法的优缺点5）盐析法操作过程中的注意事项回到二52HubeiUniversity现在是52页\一共有180页\编辑于星期四1）盐溶与盐析

盐溶就是加入中性盐后蛋白质的溶解度增大盐析就是加入中性盐后蛋白质的溶解度降低，而产生沉淀析出盐析法常用硫酸铵。因为：（1）硫酸铵在水中稳定，溶解度也大，在25℃，能得到4.1M（约55%）的浓度。（2）硫酸铵是十分温和的试剂，高浓度的硫酸铵也不会引起蛋白质变性。

53HubeiUniversity现在是53页\一共有180页\编辑于星期四盐析时蛋白质的溶解度会随着硫酸铵的浓度从0增加而增加，即所谓的“盐溶现象”当硫酸铵的浓度继续增加，蛋白质就开始变得不溶而沉淀下来，即所谓的“盐析效应”。

54HubeiUniversity现在是54页\一共有180页\编辑于星期四Saltingin■

提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：0.001M0.005M0.01M0.02M[NaCl]pIpH>5.2pH=pH0.0010.010.1NaClconcentration(M)溶解度55HubeiUniversity现在是55页\一共有180页\编辑于星期四+

=

-+

=

-■

盐溶

Salting-in：Ionicstrength溶解度+-NaClNaClKCl-+++++------+++++-------------------------++++++++++++++++++++-+++++------+++++-----分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子后，盐离子吸附于蛋白分子表面，使得蛋白分子与水分子的作用增强且蛋白分子带相同电荷而互斥，溶解度增大。56HubeiUniversity现在是56页\一共有180页\编辑于星期四Aggregate蛋白质分子表面有水化层，当加入盐时，这些水分子被抽出，与盐离子进行水合，破坏了蛋白分子表面的水化层，暴露出來的疏水性区域互相结合，形成沉淀。■

盐析

Salting-out：Ionicstrength溶解度+-+++-----+AmmoniumsulfateSodiumsulfateAlittlesalting-ineffectNH4+SO42-=hydrophobic57HubeiUniversity现在是57页\一共有180页\编辑于星期四由于各种蛋白质表面的极性基团和带电数目的不同，在蛋白质表面的分布也不同，所以溶解度小者先沉淀，溶解度大者后沉淀。利用硫酸铵分级蛋白质就是这个道理。

硫酸铵浓度与蛋白质溶解度的一般关系返回58HubeiUniversity现在是58页\一共有180页\编辑于星期四2）盐析法沉淀蛋白质的具体操作先要取少量样品做试验，以确定沉淀我们所需要的蛋白质的硫酸铵的浓度范围，实际就是绘制硫酸铵沉淀蛋白质图。

步骤▼取少量预冷样品，搅拌下加入固体硫酸铵粉末（或完全饱和的硫酸铵溶液），直到可以看到蛋白质沉淀为止，计算此时的硫酸铵饱和浓度▼离心分离蛋白质，分析上清液，以确定目的蛋白是否存在于上清液中▼如果它不在溶液中，我们就可以明确目的蛋白质存在于沉淀中，就可以初步得到我们所需要的目的蛋白质，如果它仍然存在于上清液中，则弃掉沉淀，继续加硫酸铵于上清液中，直到产生蛋白质沉淀为止☻再次计算硫酸铵饱和浓度，离心分离蛋白质，分析上清液……

59HubeiUniversity现在是59页\一共有180页\编辑于星期四硫酸铵沉淀蛋白质图

返回60HubeiUniversity现在是60页\一共有180页\编辑于星期四3）改良的硫铵分级法①首先测定提取液中蛋白质总量和目的蛋白的含量。（假定目的蛋白是一个酶，则可以通过测定它的活性作为鉴定它的标准）②分级实验实验分三个阶段，即三次第一次实验：寻找沉淀目的蛋白（酶蛋白）的硫铵浓度范围。第二次实验：进一步寻找目的蛋白（酶蛋白）得率高的盐析浓度范围，同时考虑去杂蛋白的浓度范围。第三次实验：寻找目的蛋白含量高的盐析浓度范围，同时考虑纯化系数

③分离蛋白质61HubeiUniversity现在是61页\一共有180页\编辑于星期四

第一次实验：

寻找沉淀目的蛋白（酶蛋白）的硫铵浓度范围结论：40-80%得率较理想硫铵百分饱和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）纯化系数25-40425＜140-6062222.860-803232180%以上215＜162HubeiUniversity现在是62页\一共有180页\编辑于星期四

第二次实验：

进一步寻找目的蛋白（酶蛋白）得率高的盐析浓度范围，同时考虑去杂蛋白的浓度范围。

结论：50-70%饱和度范围，酶的回收率很高（90%），但纯化系数不理想（2.4）；而第一次实验结果表明：40-60%的纯化系数是比较理想的，所以设计第三次实验提高纯化系数。

硫铵百分饱和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）纯化系数25-50632＜150-7090382.470%以上424＜163HubeiUniversity现在是63页\一共有180页\编辑于星期四

第三次实验：

寻找目的蛋白含量高的盐析浓度范围，同时考虑纯化系数

结论：选择沉淀酶的硫铵饱和度范围为55-65%硫铵百分饱和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）纯化系数25-551035＜155-657525365%以上1534＜164HubeiUniversity现在是64页\一共有180页\编辑于星期四上述的实验▼先用50%饱和度的硫铵沉淀杂质，离心除掉▼用65%的硫铵沉淀酶，收集沉淀▼将沉淀重新悬浮于55%的硫铵溶液中，此时杂蛋白溶解，酶仍是沉淀●收集沉淀

65HubeiUniversity现在是65页\一共有180页\编辑于星期四硫酸铵沉淀法分离蛋白质改良的方法：反抽提法原理：先沉淀较多的蛋白质，然后用适当的硫铵溶液抽提沉淀，去除杂蛋白，而目标蛋白仍是沉淀。蛋白质很容易从溶液中析出。但过程没有特异性。从沉淀的形式溶解下来却比较特异，在一定饱和度的硫铵溶液中，只有那些可以溶解的蛋白质才会溶解出来这也正是反抽提法的优点。66HubeiUniversity现在是66页\一共有180页\编辑于星期四4）盐析法的优缺点优点：

A.

操作简便，中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用，使用范围广泛

B.

盐析时，能除去较多的杂质，一般在70%以上，所以纯化程度较高

C.

有浓缩蛋白质溶液的作用，有利于进一步的纯化缺点：

A.

分辨能力差

B.纯化系数低返回67HubeiUniversity现在是67页\一共有180页\编辑于星期四5）盐析法操作过程中的注意事项▼要有一个特异的分析方法▼加入硫铵的速度很重要（太快，局部变性；太慢，时间长，也会变性）▼硫铵浓度通常用硫铵饱和溶液（25℃时为4.1M）的百分数表示▼硫铵溶液pH5.5左右，若目的蛋白质易于酸变性，不易用此法●样品的浓度过大，必须稀释，一般在2.5-3.0%之间比较合适返回68HubeiUniversity现在是68页\一共有180页\编辑于星期四2.有机溶剂沉淀法1）原理2）选用有机溶剂的原则3）有机溶剂沉淀法的注意事项

回到二69HubeiUniversity现在是69页\一共有180页\编辑于星期四1）原理有机溶剂会使溶液的介电常数减小，从而增强偶极离子之间的静电引力，使蛋白分子集聚沉淀。有机溶剂如是水溶性的，本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白质分子脱水而沉淀。

70HubeiUniversity现在是70页\一共有180页\编辑于星期四降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein■

有机溶剂沉淀法：Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+++++------+++++-----------++++++++++-+-+++++----+++++------+++++-----有机溶剂Solvent%=hydrophilic返回71HubeiUniversity现在是71页\一共有180页\编辑于星期四2）选用有机溶剂的原则

（1）必须能与水完全混溶；（2）不与蛋白质发生反应；（3）要有较好的沉淀效应；（4）溶剂蒸气无毒，且不易燃。（沉淀之后，有机溶剂需要蒸发或挥发掉）目前丙酮和乙醇是应用得最为广泛的有机溶剂。返回72HubeiUniversity现在是72页\一共有180页\编辑于星期四3）有机溶剂沉淀法的注意事项▼低温（0℃±l℃）下进行▼0.05mol/L以下的稀盐溶液▼按蛋白质的等电点来调节pH值，有利于它们的分离。●选择恰当的蛋白质浓度

返回73HubeiUniversity现在是73页\一共有180页\编辑于星期四3.有机聚合物沉淀法▼水溶性的中性高聚物▼原理与有机溶剂沉淀法类似▼应用最广泛的是分子量6000和20000的聚乙二醇（PEG）。●最大问题是PEG很难从蛋白质分级物中除去。回到二74HubeiUniversity现在是74页\一共有180页\编辑于星期四4.选择性变性沉淀法有些蛋白质能忍受极端环境条件（如高热或低温、高pH或低pH等）。将混合物暴露于极端条件下，不想要的蛋白质变性沉淀出来，使目的蛋白质得到纯化变性方法：热、pH和有机溶剂变性

回到二75HubeiUniversity现在是75页\一共有180页\编辑于星期四三蛋白质的脱盐和浓缩

1.脱盐

1）透析法脱盐

2）纤维过滤透析法2.浓缩回第三节76HubeiUniversity现在是76页\一共有180页\编辑于星期四1）透析法脱盐

将蛋白质放入透析袋中将此袋放入水中，或低离子强度的buffer中无机盐类和小分子的代谢产物（如ATP、辅酶等），由于扩散作用而通过半透膜被除去。77HubeiUniversity现在是77页\一共有180页\编辑于星期四每次5个小时或更长时间不停搅拌buffer或水溶液。如一次不能达到要求，可换新buffer继续透析，达到要求为止。78HubeiUniversity现在是78页\一共有180页\编辑于星期四新透析袋常被重金属、蛋白水解酶等污染，需处理。处理的办法：将透析袋放入0.5mol/LEDTA溶液中煮几次煮后要用干净的镊子和医用橡胶手套来拿。返回79HubeiUniversity现在是79页\一共有180页\编辑于星期四2）纤维过滤透析法

对非常大量的样品，可以采用纤维过滤透析法用泵使蛋白质溶液不断流经超滤膜制成的空心管，管置于透析缓冲液中，用另一泵让缓冲液不断在管外流动。这样，由于透析的有效表面积大增，使透析时间大为缩短因中空纤维超滤膜价格昂贵，分离稀有贵重蛋白时用。

返回80HubeiUniversity现在是80页\一共有180页\编辑于星期四2.浓缩1）沉淀法：用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，再将沉淀溶解在小体积溶液中2）离子交换法：使蛋白质溶液吸附到离子交换剂上，然后用少量盐溶液洗脱下来81HubeiUniversity现在是81页\一共有180页\编辑于星期四向蛋白质溶液中加入固体SephadexG－25等吸水剂，它就会吸去水及一些小分子物质吸滤，样品全部留在滤液中重复数次，在很短的时间里就能将蛋白质浓缩到理想的体积范围。3）干胶吸附法82HubeiUniversity现在是82页\一共有180页\编辑于星期四将蛋白质溶液放入半透膜中，置入一个密闭体系半透膜内的溶液通过管子与大气相通对密闭系统慢慢减压，抽真空，那么水和无机盐等小分子就会流向膜外，蛋白质即被很快浓缩，如图

至5）4）渗透浓缩法83HubeiUniversity现在是83页\一共有180页\编辑于星期四悬挂的透析袋通大气、袋外抽空减压回上一级

蛋白质溶液的超滤84HubeiUniversity现在是84页\一共有180页\编辑于星期四向密闭容器中充入N2，加压）方便、迅速、温和、处理样品量可大可小（从2～3mL到几百升）改进的管道式超滤器（以循环管道代替密闭容器），样品液可以在管道中循环流动

回到三5）超滤浓缩法85HubeiUniversity现在是85页\一共有180页\编辑于星期四蛋白质溶液的超滤（超滤器）回上页将超滤膜放在一个密闭容器的底部，而样品液放入密闭容器中，在超滤膜的上面，然后向密闭容器中充入N2，加压，这样，水分和一些低分子量的物质就通过超滤膜而流出来，而蛋白质则留在容器中，通常向密闭系统中加入的压力大约3–5万Pa。为防止大分子物质堵住膜的孔隙影响流速，常在超滤器的下面装有搅拌装置，其中搅拌子悬挂在溶液中，紧靠膜的表面，但又不能和膜接触，防止破坏膜。86HubeiUniversity现在是86页\一共有180页\编辑于星期四第四节蛋白质的进一步提纯（细分级）

回总目录蛋白质的层析分离（一）离子交换层析（二）凝胶过滤层析（三）分配层析（四）亲和层析（五）聚焦层析87HubeiUniversity现在是87页\一共有180页\编辑于星期四层析（chromatography）

原理：溶液中的分子能与固体表面进行结合及解离，但由于蛋白质在分子量、带电性和结合特异性方面的差异，与固体表面结合与解离的难易程度不一样，所以流动的速度也不一样。固定相由圆球形小珠密堆积而成。这些小珠的性质决定了可以分离哪种成分流动相固定相现在是88页\一共有180页\编辑于星期四（一）离子交换层析1、基本原理2、层析条件的选择3、技术要点4、离子交换剂的处理和再生5、管柱填装及管柱系统回第四节89HubeiUniversity现在是89页\一共有180页\编辑于星期四离子交换层析（ion-exchangechromatography）

分离所带电荷不同的物质，离子交换的支持物称为离子交换剂。

离子交换剂：离子交换树脂（anionexchangeresin）和离子交换纤维素（cationexchangeresin）,如DEAE-cellulose和CM-cellulose。不同的蛋白质与交换剂有不同的亲和力，因而可用不同盐浓浓度或pH值的buffer洗脱洗脱示意图结合洗脱曲线现在是90页\一共有180页\编辑于星期四1、基本原理：依据不同蛋白质所带电荷量的不同来进行分离的A.样品分子取代平衡离子结合于交换剂上B．洗脱液离子取代样品分子下一91HubeiUniversity现在是91页\一共有180页\编辑于星期四将解离基团引入到惰性支持物上形成离子交换层析中的固定相。如果解离基团（带电配体）带负电，则能结合阳离子，称为阳离子交换剂；如果解离基团带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂（如上图所示离子交换剂）。当pH>pI时，蛋白分子带负电，可结合于阴离子交换剂上；当pH<pI时，蛋白分子带正电，可结合于阳离子交换剂上。92HubeiUniversity现在是92页\一共有180页\编辑于星期四电荷密度越大，结合越牢，在柱中移动速度越慢，从柱中被洗脱掉的速度就慢。不同的蛋白所带电荷不同，对离子交换剂的结合力就有差异，提供了分离蛋白质混合物的可能性；混合物中的各蛋白分子差异大，易分离；差异小，难分离；没有差异就不能分离。最根本原理就是依据不同蛋白质所带电荷量的不同来进行的93HubeiUniversity现在是93页\一共有180页\编辑于星期四■阴离子交换法

AnionExchange：载体++++++++++++++++样本分子流动相固定相阳离子基团Counterion阴离子+94HubeiUniversity现在是94页\一共有180页\编辑于星期四■离子取代优先顺序PeckingOrder：++++++++++++++++++>>电荷高者离子大者浓度大者>95HubeiUniversity现在是95页\一共有180页\编辑于星期四离子交换层析（ion-exchangechromatography）现在是96页\一共有180页\编辑于星期四■不同胶体的吸著容量有很大差异：DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50DEAE-SepharoseCL-6BDEAE-Sephacel乳白蛋白清蛋白铁蛋白1911045383110211586214.38.6Buffer:0.01MTris-HCl,pH8.0mg/mLgel97HubeiUniversity现在是97页\一共有180页\编辑于星期四采用盐梯度或pH梯度进行洗脱。盐浓度从低到高对应洗下来的就是带电量从少到多的蛋白质。对带正电蛋白质的洗脱而言，pH梯度要从低到高，对带负电蛋白质的洗脱而言，pH梯度要从高到低pH向等电点方向变化，削弱蛋白质与交换剂的结合能力。当pH达到某种分子的等电点（pI）时，该分子失去电荷，而从交换剂上被洗脱下来。洗脱98HubeiUniversity现在是98页\一共有180页\编辑于星期四■离子交换的梯度溶离有浓缩效果：SaltgradientelutionbeginsSampleapplied99HubeiUniversity现在是99页\一共有180页\编辑于星期四2、层析条件的选择

（1）交换剂颗粒大小的选择（2）层析缓冲液的选择返回100HubeiUniversity现在是100页\一共有180页\编辑于星期四（1）交换剂颗粒大小的选择粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒子分辨率低，单位体积的交换容量小，但流速较快。细粒子分辨力高、交换容量大，但是流速慢。细粒子适于装小柱，直径1mm的柱也可以。回到2101HubeiUniversity现在是101页\一共有180页\编辑于星期四（2）层析缓冲液的选择为避免缓冲液离子参与离子交换过程，它所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂时，要用阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等）；使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（Tris、胺盐、吡啶等）。102HubeiUniversity现在是102页\一共有180页\编辑于星期四3、技术要点★柱床体积至少要比样品的大2～5倍★样品应与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度★洗脱速度太快或太慢都会降低柱的分辨率▲部分收集器每管收集样品的量，关系到能否充分表达层析柱的分辨率

返回103HubeiUniversity现在是103页\一共有180页\编辑于星期四4、离子交换剂的处理和再生

返回预处理:dH2O

浸泡2hrsdH2O

洗2MHCl(4V)4hrs2MNaOH(4V)4hrsdH2O

至中性再生:dH2O

洗2MNaCl(2V)

水洗2MHCl(4V)

水洗2MNaOH(4V)

水洗dH2O

至中性104HubeiUniversity现在是104页\一共有180页\编辑于星期四■胶柱的装填方法：缓冲液平衡温度平衡静置胶体清洗胶体预估体积装填胶体暂停流洗X继续流洗加上

reservoir已堆积沉积中上清加压流洗加上

adaptor紧密堆积检查好管柱是否畅通12GelGel5、管柱填装及管柱系统

105HubeiUniversity现在是105页\一共有180页\编辑于星期四■液相层析管柱系统：缓冲液梯度制造器泵记录器监视器管柱胶体分部收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapter转接器106HubeiUniversity现在是106页\一共有180页\编辑于星期四（二）凝胶过滤层析

凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。它主要用于分离分子大小不同的的样品。凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，因此在生化研究中应用极其广泛。回第四节1、基本原理2、凝胶层析的介质3、凝胶过滤的操作及应用107HubeiUniversity现在是107页\一共有180页\编辑于星期四1、基本原理凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，分子直径比凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微孔里，只能随溶剂一起移动的，最先流出柱外；分子直径比凝胶孔径小的分子，即进入凝胶相内，延长了路径，向下移动的速度落后于大分子。这种情况如下图所示。

108HubeiUniversity现在是108页\一共有180页\编辑于星期四■装于柱中的凝胶支持物及某些层析参数示意图

样本固定相流动相小分子被延滯小分子大分子依据分子大小、形状较快流出返回109HubeiUniversity现在是109页\一共有180页\编辑于星期四2、凝胶层析的介质

对凝胶层析支持物的要求是：第一：要有惰性，即凝胶介质与溶质不发生任何作用；第二：离子基团含量要低，即所带电荷要尽可能低；第三：凝胶颗粒的孔度和大小要均一；第四：凝胶颗粒和孔度大小的选择范围要宽，能适应各种不同大小的分子的分离；第五：机械强度要高。现在有3种介质在不同程度上满足这些要求。返回110HubeiUniversity现在是110页\一共有180页\编辑于星期四胶体的种类:

葡聚糖凝胶用1,2-环氧氯丙烷作交联剂,将由葡萄糖经-1,6糖苷键结合而成的线性葡聚糖聚合成高分子聚合物。商品名为Sephadex(G-10200共8种)

琼脂糖凝胶

由D-半乳糖和3,6-脱水L-半乳糖相间结合形成的多糖,是将琼脂中的琼脂胶除去而得到的。商品名为Sepharose(2B、4B和6B)。

聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺经交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成的高分子聚合物。商品名为Bio-gel(P2-300)111HubeiUniversity现在是111页\一共有180页\编辑于星期四■各种层析胶体：PharmaciaBio-RadSephadexSepharoseSephacrylSephacelBioGelPBioGelAglucose(dextrose)agaroseglucose+acrylamidecelluloseacrylamideagaroseFPLCSuperose,SuperdexMonoQ,MonoS112HubeiUniversity现在是112页\一共有180页\编辑于星期四■胶体的构成：Sephadexglucoseunit过滤空间113HubeiUniversity现在是113页\一共有180页\编辑于星期四■胶体的使用范围：

SephadexG：●

分子量由数万至数十万胶体容易被压扁1g→20mLgel1g→7.5mL(骨架较稀)Smallproteins114HubeiUniversity现在是114页\一共有180页\编辑于星期四■胶体过滤法的胶球：115HubeiUniversity现在是115页\一共有180页\编辑于星期四■管柱內胶体的组成区间：VtVoVt-

Vo管柱总体积胶体外体积胶体內体积流动相固定相116HubeiUniversity现在是116页\一共有180页\编辑于星期四

凝胶上柱后，颗粒外的外水体积（Vo），颗粒内体积称内水体积（Vi），颗粒中胶的体积（Vg），因而，总的柱床体积（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi

。

当进行洗脱时，某一溶质的洗脱体积（Ve）就取决于Vo，Vi和在两相中的分配系数（kd）

Ve=Vo+kd·Vi

现在是117页\一共有180页\编辑于星期四①当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo

出来，无分配。②当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。③当0<kd<1时,Ve=Vo+kd·Vi各溶质具不同分配，以得到分离。

若已知某一物质的kd，可据上式计算它的洗脱体积（Ve）也可用溶质洗脱峰处的洗脱体积来测量。用此法来分离介质是以下述三种形式来描述的：现在是118页\一共有180页\编辑于星期四■凝胶过滤的溶离图谱：XYZEEnzymeactivityNaClVo之前不应有物质溶离出來Vt之后不应有物质溶离出來目标酶

(E)最好不要落在主要蛋白质峰(Y)的范围內ElutionVolume(mL)AVoVeVt0119HubeiUniversity现在是119页\一共有180页\编辑于星期四■胶体粒子的粗细会影响溶离液的流动：胶体的颗粒越小其解析力越大

但流速变慢120HubeiUniversity现在是120页\一共有180页\编辑于星期四■层析管柱的形状：10cm230cm10cm30cm2300cm3矮胖型细长型●

矮胖型管柱不能容忍分离不佳

其流速及容量均较大121HubeiUniversity现在是121页\一共有180页\编辑于星期四3、凝胶过滤的操作及应用Sephadex柱高度约需1m，Sephacryl柱高度可为0.7m。分离大分子时，柱床体积应为上样体积的25～100倍，柱高与直径之比为20：1～100：1。装柱要在搅拌下连续操作，一气呵成。122HubeiUniversity现在是122页\一共有180页\编辑于星期四■胶柱的装填方法：缓冲液平衡温度平衡静置胶体清洗胶体预估体积装填胶体暂停流洗X继续流洗加上

reservoir已堆积沉积中上清加压流洗加上

adaptor紧密堆积检查好管柱是否畅通12GelGel123HubeiUniversity现在是123页\一共有180页\编辑于星期四■层析管柱系统：缓冲液梯度制造器泵记录器监视器管柱胶体胶体装填分部收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapterreservoir转接器124HubeiUniversity现在是124页\一共有180页\编辑于星期四

极性相似的两分子间，其亲和力较強。极性

→

极性非极性

→

非极性LikeDissolvesLike（三）分配层析法

125HubeiUniversity现在是125页\一共有180页\编辑于星期四3.1

分配层析法的演示过程：圆形滤紙长条滤紙薄层层析(TLC)柱状层析容量变大容量更大加展开液Paperpartitionchromatography(PPC)126HubeiUniversity现在是126页\一共有180页\编辑于星期四一个

板数■分配层析法的板数概念：BBBBBBBBBBBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABBBBBBBBBB8020109064161916498151130131873极性非极性100A+100B127HubeiUniversity现在是127页\一共有180页\编辑于星期四■薄层层析法操作：Thin-layerchromatography薄层板点好样本加展开液样本展开128HubeiUniversity现在是128页\一共有180页\编辑于星期四（四）亲和层析

回第四节★亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。★亲和层析从理论上讲，能产生一个绝对的纯化作用，因此，可达到很高的纯度。★分离快速，对分离含量极少又不稳定的活性物质极为有效。129HubeiUniversity现在是129页\一共有180页\编辑于星期四■亲和层析法的作用机理：固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团配体XBAA130HubeiUniversity现在是130页\一共有180页\编辑于星期四亲和层析（affinitychromatography）现在是131页\一共有180页\编辑于星期四

竞争性洗脱改变离子强度洗脱

PH洗脱变性剂洗脱打断配体化学键洗脱洗脱方法132HubeiUniversity现在是132页\一共有180页\编辑于星期四1、载体亲和层析的载体多为凝胶，可分成两类：一是大网孔型，如琼脂糖凝胶其大孔网状结构容许大分子自由进出凝胶；二是微孔型，如交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酸胺凝胶，其小网孔型的立体结构使大分子排阻在凝胶颗粒之外。

基质载体:CelluloseSephadexBio-gelBio-glassSepharose133HubeiUniversity现在是133页\一共有180页\编辑于星期四2、配体★专一性结合，且亲和力越大越好；★结合后又能解离，而且，无损于生物大分子的生物活性；▲适当的化学基团，把配体偶联到载体上，且不损害配体与生物大分子的专一性结合。

配体是亲和层析中最重要成分。选择好的配体有三个标准：134HubeiUniversity现在是134页\一共有180页\编辑于星期四用于亲和层析的配体：配体:

竞争性抑制剂辅酶底物金属离子(CuNiMnZn)

染料135HubeiUniversity现在是135页\一共有180页\编辑于星期四3、“手臂”的作用下图形象地说明了载体空间位阻的影响和“手臂”对亲和吸附的作用。

A.无法“吻合”；B．借助“手臂”完全“吻合”载体载体136HubeiUniversity现在是136页\一共有180页\编辑于星期四亲和层析中使用最多的“手臂”是NH2－（CH2）n-R类化合物。R可以是羧基、氨基、也可以就是配体。要使配体和互补生物大分子的相互作用处于最佳状态，“手臂”中亚甲基的数目至少是4～6个，常用的长度是6～10个。137HubeiUniversity现在是137页\一共有180页\编辑于星期四Activity■4典型的亲和层析操作：ElutionvolumeProteinpH2.05*138HubeiUniversity现在是138页\一共有180页\编辑于星期四■专一性结合力量的构成因素：I.ConformationalMatch:VanderwaalsinteractionII.InteractionForces:(1)Hydrogenbond(2)Hydrophobicinteraction(3)Electrostaticinteraction(4)Vanderwaalsinteraction+Kd两分子间因构形互补所造成的吸引力是由范德华力所贡献+-=O…H-N-139HubeiUniversity现在是139页\一共有180页\编辑于星期四■构形互补所造成的吸引力：VanderWaalinteractionsbetweennon-polarsurfacesvdwvdw范德华键数目夠多即足以造就亲和力140HubeiUniversity现在是140页\一共有180页\编辑于星期四■各种亲和性介质及其专一性基团：免疫吸附剂，大多自行合成

单株抗体纯化对

a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性

HeparinSepharoseCL-6BBlueSepharoseCL-6B5'AMP-,2',5'ADP-Sepharose4B用来纯化

lectin酶的专一性结合Oligo(dT)-cellulose配体

亲和性分子

说明(还有更多其它亲和配体及介质)Oligo(dT)抗体

底物或抑制剂ProteinConAHeparinCibacron-BlueAMP,ADP单糖及衍生物对应的酶对应的抗原LectinNAD(P)+结合酶NAD(P)+结合酶mRNA部分IgG糖蛋白凝血蛋白等Pharmacia141HubeiUniversity现在是141页\一共有180页\编辑于星期四■金属螯合层析法：Ni

固相载体HisHisHisProteinMetalChelateAffinityChromatographyimidazole咪唑elution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOHC-COOHC-COOHOH142HubeiUniversity现在是142页\一共有180页\编辑于星期四■亲和层析法实例的原始材料：载体Chitin配体CHOM鸡蛋粘多糖蛋白胰蛋白脢的抑制劑目标分子TrypsinOOCH2OHOH

NH2OOCH2OHOH

NHO=CH3143HubeiUniversity现在是143页\一共有180页\编辑于星期四■以亲和层析法纯化

Trypsin：CHOMTrypsinABC&D以凝胶电泳检测亲和层析操作过程各步骤的样本Chitin144HubeiUniversity现在是144页\一共有180页\编辑于星期四★若只有一种待分离的物质吸附在柱上，选用一种合适的缓冲液进行洗脱即可。★若同时有几种物质吸附在柱上，而且彼此亲和力相差较大，可用阶段洗脱方式进行洗脱。

★若彼此亲和力相差很小时，则必须采用梯度洗脱方式进行层析分离。非专一性洗脱通过改变缓冲液的离子强度或者pH或者介电常数或者同时改变其中的两种因素，使吸附的大分子的构象发生改变，以降低其与配体间的亲和力，从而将其从柱上洗下。145HubeiUniversity现在是145页\一共有180页\编辑于星期四配制专一性洗脱剂的原则是：①洗脱液中的游离配体最好与固定化配体不同；②洗脱液中的配体应对欲分离物质有较高的亲和力；③洗脱液中游离配体的浓度要视固定化配体与待分离物的亲和力而定。亲和力大，所用浓度大；亲和力弱，所用浓度低。

专一性洗脱采用含有待分离物质配体的缓冲液进行洗脱146HubeiUniversity现在是146页\一共有180页\编辑于星期四蛋白质在亲和层析柱上的吸附和洗脱条件147HubeiUniversity现在是147页\一共有180页\编辑于星期四（五）聚焦层析

Chromatofocusing

优点：①pH梯度自动产生，省去了梯度混合装置，因此所用仪器设备简单；②有聚焦效应，能产生很窄的分离区带，峰宽度可达0.04～0.05pH单位，因此，分辨率很高；③所用的多元缓冲液和多元缓冲交换剂有商品供应，且易于使用；④分离容量大，整个操作类似于一般的离子交换层析，非常简单容易；⑤此法适用于任何水溶性的两性分子，如，蛋白质、酶、多肽和核酸等。（1）方法的原理pH梯度的形成（2）聚焦机制回第四节148HubeiUniversity现在是148页\一共有180页\编辑于星期四等电聚焦

Chromatofocusing其介质也是一种离子交换介质但所使用的

Polybuffer

可拉出稳定的pH梯度149HubeiUniversity现在是149页\一共有180页\编辑于星期四■等电聚焦法如何拉出pH梯度：●

Polybuffer

含有连续

pKa

的缓冲分子(ampholyte)

可拉出连续

pH梯度9876

聚焦层析的pH梯度是利用离子交换剂本身的带电基团与洗脱缓冲液的相互作用，在洗脱过程中自动形成的。150HubeiUniversity现在是150页\一共有180页\编辑于星期四++++■等电聚焦法的聚焦机制：8765+++++-0+Polybuffer聚焦在等电点在低pH处带正电被排斥151HubeiUniversity现在是151页\一共有180页\编辑于星期四聚焦效应

在区带后面的蛋白质分子不被凝胶结合，它移动的速率比走在它前面的蛋白质分子更快，如果在第一份样品上柱后加入第二份同种样品，它将赶上第一份样品，并与第一份样品同时洗出，如果第二份样品的等电点比第一份样品更高，它将超过第一个区带而先被洗出

152HubeiUniversity现在是152页\一共有180页\编辑于星期四●

抹香鲸肌紅蛋白(pI=8.2)追过

马肌红蛋白(pI=7.4)153HubeiUniversity现在是153页\一共有180页\编辑于星期四第五节蛋白质的电泳分离

一、电泳的类型二、聚丙烯酰胶凝胶电泳三、凝胶免疫电泳四、高效毛细管电泳

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