微生物细胞破碎复性

微生物细胞破碎复性第1页，共84页，2023年，2月20日，星期四

几种产品在发酵液中的浓度产品典型浓度（g/L）抗生素25

氨基酸100

酒精100

有机酸100

酶20

蛋白质10第2页，共84页，2023年，2月20日，星期四下游加工技术的特点:1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性;

2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定;

3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。第3页，共84页，2023年，2月20日，星期四产物提纯过程的不同决定于：

对象材料目标产物特性对其纯度的要求第4页，共84页，2023年，2月20日，星期四基因工程生物制品分离纯化:工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高分离纯化极其重要基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。第5页，共84页，2023年，2月20日，星期四发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包涵体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂

产品

基因工程制品分离纯化的一般流程第6页，共84页，2023年，2月20日，星期四初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。纯化精制：初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。产物提纯过程包括两个基本阶段：第7页，共84页，2023年，2月20日，星期四总原则：

控制时间、温度、pH值，减少与空气接触的机会，设计好各组分的分离顺序.第8页，共84页，2023年，2月20日，星期四第二节细胞破碎第9页，共84页，2023年，2月20日，星期四酶来源应用范围L-天冬酰氨酶EruiniaCaratovoraEscherichiaColi治疗急性淋巴癌过氧化氢酶Aspergillusniger牛奶灭菌后H2O2的清除胆固醇氧化酶Nocardiahodochrous胆固醇浆液分析β-半乳糖苷酶KluyveromycesfragilisSaccharomyceslactis在牛奶/乳清中乳糖的水解作用葡萄糖氧化酶AspergillusnigerPenicilluimnotatum葡萄糖浆液分析食品中氧的清除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Yeast临床分析蔗糖酶SaccharomycesCerevisiae糖果、蜜饯青霉素酰化酶EscherichiaColi苄青霉素的脱酰作用表1胞内酶举例细胞破碎的必要性第10页，共84页，2023年，2月20日，星期四药物名宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤表2几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物第11页，共84页，2023年，2月20日，星期四细胞壁的组成与结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20~8010~13100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40％～90％）、多糖、胞壁酸、蛋白质、脂多糖（1％～4％）肽聚糖（5％～10％）脂蛋白、脂多糖（11％～22％）磷脂、蛋白质葡聚糖（30％～40％）甘露聚糖（30％）、蛋白质（6％～8％）、脂类（8.5％～13.5）多聚糖（80％～90％）脂类、蛋白质第12页，共84页，2023年，2月20日，星期四

图1革兰氏菌细胞壁结构图（a）革兰氏阳性菌（b）革兰氏阴性菌第13页，共84页，2023年，2月20日，星期四

图2酵母细胞壁的结构示意图M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖第14页，共84页，2023年，2月20日，星期四

微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。内因：连接细胞壁网状结构的共价键;外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等。第15页，共84页，2023年，2月20日，星期四破碎程度的评价

破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。

破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：

Y（%）=[（N0-N）/N0]*100

其中N0——原始细胞数量；

N——经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。第16页，共84页，2023年，2月20日，星期四N0和N的确定方法：直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。第17页，共84页，2023年，2月20日，星期四细胞破碎技术第18页，共84页，2023年，2月20日，星期四其他新的细胞破碎方法：

激光破碎法冷冻-喷射法高速相向流撞击法第19页，共84页，2023年，2月20日，星期四细胞声波搅拌液压冷冻压力动物细胞7777革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌6566革兰氏阳性芽孢杆菌5(4)54酵母3.5342.5革兰氏阳性球菌3.5(2)32.5孢子2(1)21菌丝16(1)5表细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。第20页，共84页，2023年，2月20日，星期四常用的破壁方法珠磨法高压匀浆法超声波破碎法X-press法机械法非机械法酶溶法化学渗透法渗透压法冻结融化法干燥法第21页，共84页，2023年，2月20日，星期四1、常用的破壁方法——珠磨法图3水平搅拌式珠麿机结构示意图1—细胞悬浮液2—细胞匀浆液3—珠液分离器4—冷却液出口5—搅拌电机6—冷却液进口7—搅拌桨8——玻璃珠原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。第22页，共84页，2023年，2月20日，星期四几种常见珠磨器第23页，共84页，2023年，2月20日，星期四

破碎作用遵循一级动力学定律：

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破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。第25页，共84页，2023年，2月20日，星期四

一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm较好，工业规模不得小于0.4mm。

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有研究表明，减小磨珠直径起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。

eg.从酵母细胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如1mm直径）磨珠。第27页，共84页，2023年，2月20日，星期四

在一定范围内，增加珠体装填量可以提高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。

为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。

一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-90%，并随珠体大小变化。第28页，共84页，2023年，2月20日，星期四

细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用Netzsch(耐池）LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制在40%左右。第29页，共84页，2023年，2月20日，星期四Currie等人的研究表明，操作温度控制在5-400C范围内对破碎物的影响较小。常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨室的温度。第30页，共84页，2023年，2月20日，星期四2、常用的破壁方法——高压匀浆图5高压匀浆机装置图组成：高压泵和匀浆阀作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。第31页，共84页，2023年，2月20日，星期四第32页，共84页，2023年，2月20日，星期四第33页，共84页，2023年，2月20日，星期四高压匀浆法动力学方程破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：单位生物量释放出的产物量（mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常数；N：破碎次数；P：操作压力；a:与微生物性质有关的指数系数。第34页，共84页，2023年，2月20日，星期四

此方法中影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。

有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由500C变为300C，破碎率约提高1.5倍。

第35页，共84页，2023年，2月20日，星期四图7细胞浓度及压力大小对破碎率的影响匀浆次数图8匀浆次数对破碎效果的影响第36页，共84页，2023年，2月20日，星期四破碎率---操作压力----温度控制----能耗温度对活性物质的失活作用提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa移走热量需付出代价高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却匀浆过程中产生的热→蛋白质和酶的失活温控和能耗第37页，共84页，2023年，2月20日，星期四堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用；温度高易失活，能耗大。存在的问题第38页，共84页，2023年，2月20日，星期四高压匀浆法与高速珠磨法的比较项目高压匀浆法高速珠磨法操作参数少多，液体损耗大连续操作时配备热换器进行级间冷却兼具破碎和冷却，减少产物失活达到较高破碎率需循环2-4次一次操作适用范围团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不宜，包含体不宜几乎所有的微生物细胞，包括含有包含体的基因工程菌的破壁第39页，共84页，2023年，2月20日，星期四3、常用的破壁方法——超声波破碎作用机理：空化现象

由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲击波的现象。第40页，共84页，2023年，2月20日，星期四空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。锡箔纸测试空化强度与空化密度看得到的空化现象第41页，共84页，2023年，2月20日，星期四

超声波振动在液体中传播的音波压强达到1atm时，功率密度为0.35w/cm2，这时超声波的音波压强峰值可达真空或负压，但实际上无负压存在，因此在液体中产生一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞-空化核。此空洞非常接近真空，在超声波压强方向达到最大时破裂。

第42页，共84页，2023年，2月20日，星期四图10USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机图9超声波细胞破碎仪的结构示意图第43页，共84页，2023年，2月20日，星期四振幅细胞悬浮液的黏度表面张力被处理悬浮液的体积探头的形状和材料细胞悬浮液的流速影响参数第44页，共84页，2023年，2月20日，星期四

超声破碎优点：操作简便，液量损失少；存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。第45页，共84页，2023年，2月20日，星期四

常用酶：

溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等。

4、常用的破壁方法——酶溶法

作用机理：

利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。第46页，共84页，2023年，2月20日，星期四eg.蜗牛酶——从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种。第47页，共84页，2023年，2月20日，星期四

在某些情况下，不加外源酶也可使某些微生物发生自溶。

eg.谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌）加入pH10的缓冲液（0.028mol/LNa2CO3—0.018mol/LNaHCO3

），配3%的细胞悬浮液，加热至700C，保温搅拌20min，菌体即自溶。

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优点：一定的选择性；细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程。

缺点：（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；通用性差，不易确定最佳条件；第49页，共84页，2023年，2月20日，星期四

所用的化学试剂：酸、碱、表面活性剂、脂溶性有机溶剂、EDTA鳌合剂、变性剂等。5、常用的破壁方法——化学渗透法

作用机理：改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。第50页，共84页，2023年，2月20日，星期四酸、碱：用来调节溶液的pH值，改变细胞所处环境，改变蛋白质的电荷性；有机溶剂：常用的是甲苯，被细胞壁脂质层吸收后导致胞壁膨胀，造成细胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。第51页，共84页，2023年，2月20日，星期四表面活性剂：天然的如胆酸盐、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。变性剂：如盐酸胍，与水中氢键作用，消弱溶质分子间的疏水作用。第52页，共84页，2023年，2月20日，星期四EDTA：破坏细胞壁的外层膜；甲苯：溶解细胞膜的磷脂层；TritonX-100：溶解内膜的双磷脂层；盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液。第53页，共84页，2023年，2月20日，星期四eg.1.某些动物细胞（肿瘤细胞）可采用SDS、去氧胆酸钠等破坏细胞膜；而细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果较好。

2.用Triton从一种诺卡氏菌中选择性地提取胆固醇氧化酶。第54页，共84页，2023年，2月20日，星期四

温和化学渗透剂

温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量较小的非极性Ｒ基氨基酸。其破碎机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙氨酸更易渗透到细胞壁中,通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构,从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。第55页，共84页，2023年，2月20日，星期四细胞类别变性剂清洁剂有机溶剂酶抗生素生物试剂鳌和剂革兰氏阴性菌******革兰氏阴性菌***酵母菌******植物细胞****巨噬细胞**表4不同细胞可采用的化学渗透处理方式*表示适用第56页，共84页，2023年，2月20日，星期四优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷：时间长，效率低；化学试剂有毒；通用性差。第57页，共84页，2023年，2月20日，星期四细胞破碎机理图第58页，共84页，2023年，2月20日，星期四机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。5、常用的破壁方法——微波加热法第59页，共84页，2023年，2月20日，星期四

优点：

微波穿透性强，选择性高、加热效率高。

缺陷：一般只适合对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和树胶等的天然植物。第60页，共84页，2023年，2月20日，星期四机械破碎法与非机械破碎法的比较比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜碎片大小碎片细小细胞碎片较大内含物释放全部部分黏度高（核酸多）低（核酸少）时间，效率时间短，效率高时间长，效率低设备需专用设备不需专用设备通用性强差经济成本低成本高应用范围实验室，工业范围实验室范围第61页，共84页，2023年，2月20日，星期四细胞破壁技术注意事项

多种破碎方法相结合与下游过程相结合与上游过程相结合第62页，共84页，2023年，2月20日，星期四小结：细胞破碎主要方法第63页，共84页，2023年，2月20日，星期四思考:1、微生物细胞破碎的原理是什么？有哪些具体的方法？2、G+菌、G—菌以及酵母菌细胞壁的差别在哪里？3、请指出珠磨法与高压匀浆法各自的原理及适用范围。4、细胞破壁应注意哪些问题？第64页，共84页，2023年，2月20日，星期四克隆表达的产物基因工程细胞蛋白质没有活性，一级结构正确，立体构型错误，无生物学活性！——包涵体第三节蛋白质复性难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。第65页，共84页，2023年，2月20日，星期四病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构——包涵体SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies第66页，共84页，2023年，2月20日，星期四

包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。）缺少某些协助因子（分子伴侣？？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。应该考虑的事：设法减少包含体的形成！第67页，共84页，2023年，2月20日，星期四

减少包涵体形成的策略1、

降低重组菌的生长温度

降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。第68页，共84页，2023年，2月20日，星期四培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输；其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、pH等。2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂第69页，共84页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。如何使包涵体的构型复原成正确状态？第70页，共84页，2023年，2月20日，星期四包含体的分离及溶解

分离包含体：对培养收集的细胞进行破碎

(高压匀浆结合溶菌酶处理)，然后离心(5000~20000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。洗涤：除去脂类和膜蛋白的包涵体沉淀，一般加去污剂（TritonX-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤，以避免包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。第71页，共84页，2023年，2月20日，星期四溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。以异氰盐酸胍的增溶效果最强，尿素稍差；去污剂（如SDS）可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸（如70%甲酸）可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。第72页，共84页，2023年，2月20日，星期四对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。第73页，共84页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的折叠机理

目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构。第74页，共84页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的具体步骤可用下式描述：伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体第75页，共84页，2023年，2月20日，星期四核糖核酸酶的变性和复性示意图(A)天然核糖核酸酶(B)变性失活(C)“错乱”核糖核酸酶第76页，共84页，2023年，2月20日，星期四

错误发生的机制①复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集；②伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。第77页，共84页，2023年，2月20日，星期四不同条件下具体复性方式1、透析、稀释和超滤复性法：最传统、应用最普遍，原理--使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。

缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。第78页，共84页，2023年，