实验四尿标本的微生物学检验

实验四尿标本的微生物学检验第1页，共46页，2023年，2月20日，星期四实验目的：掌握尿液标本的采集与处理、常见病原菌及一般微生物学检验程序和细菌计数方法。掌握大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌的微生物学鉴定方法和生物学性状。第2页，共46页，2023年，2月20日，星期四尿标本的采集与处理：正常人的尿液通常是无菌的，但在外尿道除有正常菌群外，尚有其他一些病原菌和条件致病菌，可通过多种途径引起尿路感染（urinarytractinfection,UTI）。如：葡萄球菌、链球菌、肠球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌等。标本采集方法常有五种：导尿法、中段尿采集法、肾盂尿采集法、膀胱穿刺采集法、留尿法。第3页，共46页，2023年，2月20日，星期四1）导尿法：采取导尿管导尿，是一种较好的无菌采集法，可直接插导管采集尿液标本或滞留导管集尿。直接导尿先让尿流弃15ml，滞留导管集尿先用70%酒精消毒导管口再用针筒抽取，取尿量为10～15ml，直接导尿有将尿道细菌进入膀胱的危险，尽量避免此方法。2）中段尿采集法：目前国内临床常用此法。女性病人先用肥皂水或1:1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及尿道口；男性病人应翻转包皮冲洗，用1:1000新洁尔灭消毒尿道口；用无菌生理盐水或无菌水冲去消毒液，再用灭菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前段尿，收集中段尿10～20ml，置于无菌容器内，立即加盖送检。第4页，共46页，2023年，2月20日，星期四3）肾盂尿采集法：由泌尿科医生在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液，并做好标记，以防左右侧错位，尿液采集量不少于1ml。4）膀胱穿刺采集法：在病人耻骨上膀胱区用碘酒、酒精消毒（要求病人不排尿充盈膀胱）以无菌针筒做膀胱穿刺，抽取尿液后针筒插入橡皮塞送检。此法主要用于厌氧培养。5）留尿法：疑为尿道结核患者，可用一洁净容器，留取24h尿液，取其沉淀部分盛于清洁瓶内送检。第5页，共46页，2023年，2月20日，星期四通常取晨起第一次尿送检。由于治疗所用药物多数均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液都宜在用药前进行。尿液标本的采取和培养最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作尿液标本中不得加防腐剂，否则会影响检出的阳性率。尿液标本采集后要立即送检（常规2h内）或存放于4℃冰箱（不超过24h，教材规定为8h），因搁置时间稍长尿中病原菌可在室温中增殖，而影响细菌计数的正确性。应注意淋病奈瑟菌培养时标本不能冷藏保存。第6页，共46页，2023年，2月20日，星期四常见病原菌：

医院内引起UTI的病原菌70%为革兰氏阴性杆菌，其中以肠杆菌科和假单胞菌属的细菌为主；革兰氏阳性菌约占20%，其中以葡萄球菌和肠球菌为多见。由于抗菌素的广泛应用，近年来真菌性UTI增多，约占10%。第7页，共46页，2023年，2月20日，星期四检验程序：

尿标本直接涂片染色分离培养

细菌计数直接药敏试验（特殊细菌检查离心沉淀）BA、中国蓝或麦康凯平板（常规培养）血清学鉴定生化鉴定药敏试验确定病原菌定量培养直接计数35℃18～24h观察菌落形态、涂片染色镜检发报告第8页，共46页，2023年，2月20日，星期四检验程序：革兰阴性杆菌

氧化酶（Oxi）-+肠杆菌科细菌非发酵菌

氧化酶阴性非发酵菌：不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。氧化酶阳性其他革兰阴性菌：巴斯德菌、气单胞菌、邻单胞菌

和弧菌属等也是氧化酶阳性。第9页，共46页，2023年，2月20日，星期四麦康凯平板（Mac）：

是一种肠道杆菌专用的弱选择性培养基。培养基成分中除基础成分外，主要含有0.5%胆盐、1%乳糖、中性红指示剂。

胆盐：一方面对沙门氏菌有刺激生长作用，另一方面对革兰氏阳性菌及大肠埃希氏菌有抑制作用。

1%乳糖：作为一种指示糖。

中性红指示剂：pH6.8—8.4，由红—黄。（分解乳糖的细菌产酸，使菌落周围胆盐堆积变浑浊）第10页，共46页，2023年，2月20日，星期四实验器材：1、标本：1#、2#、3#模拟尿液标本。2、培养基：BA、Mac、普通营养琼脂、KIA、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水。3、试剂：9.9ml无菌生理盐水、革兰染液、氧化酶试剂、3%H2O2、靛基质试剂、甲基红试剂、VP甲液、VP乙液、10%FeCl3、硝酸盐还原试剂甲液、硝酸盐还原试剂乙液。4、其它：无菌空平皿、载玻片等。第11页，共46页，2023年，2月20日，星期四实验方法：一、分离培养

用无菌方法将1#、2#、3#模拟尿液标本分别划线接种于BA、Mac上，置35℃培养18—24小时。二、直接涂片染色

取上述1#、2#、3#标本分别作涂片、革兰氏染色、镜检。（要求绘图并描述）三、细菌计数（倾注平板法）0.1ml尿液9.9ml无菌NS混匀

取0.1ml（1:1000稀释）标本

无菌空平皿倾入10～15ml加热融化并冷至50℃±的无菌营养琼脂，混匀35℃培养18～24h。第12页，共46页，2023年，2月20日，星期四0.1ml尿液9.9mlNS1:100稀释标本0.1ml总稀释倍数1:1000第13页，共46页，2023年，2月20日，星期四四、结果观察：1、细菌计数

1）结果记录：

2）结果计算：每ml尿液细菌数=菌落平均数×稀释倍数

3）结果判断标准：

尿标本中细菌的计数，主要是根据尿中细菌的多少来判断是否感染。一般认为，细菌计数：＜104/ml为污染

＞105/ml为感染104~105/ml为可疑

第14页，共46页，2023年，2月20日，星期四

目前认为由革兰氏阴性杆菌引起的菌尿，其菌数均可达到＞105/ml，而球菌所引起的菌尿，其菌数达到104/ml，即可作为尿路感染的标准（因不同细菌繁殖速度快慢不一，在同一时间内细菌繁殖数应该是：革兰氏阴性杆菌＞葡萄球菌＞肠球菌）。为此，作菌尿计数时，必须与涂片染色结果结合，作出报告。

以下几种情况均可使尿液中菌数＜104/ml：

（1）应用了低敏感性抗菌药物，尿液中细菌受到一定抑制。（2）

患者大量输液或使用利尿剂后。

（3）尿液pH值失常，当pH＜5.8或pH＞8.5时，细菌生长受阻。（4）尿频时，膀胱内的菌停留时间短则细菌数少。（5）某些菌的繁殖能力低。第15页，共46页，2023年，2月20日，星期四2、菌落形态描述：（BA、Mac分别描述）1#标本：2#标本：3#标本：3、菌体形态观察：

分别取1#、2#、3#标本的BA、Mac培养物涂片、革兰染色、镜检。（要求绘图并描述、对比BA、Mac菌体形态差异）

BA：Mac：第16页，共46页，2023年，2月20日，星期四五、鉴别试验:1、氧化酶（Oxidase）试验：原理：

氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。氧化酶试验中，酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现显色反应。试剂：1％盐酸四甲基对苯二胺或

1％盐酸二甲基对苯二胺方法：直接法和试剂纸片法

直接法：用滤纸片刮取待检菌菌落（切勿刮到培养基），在有菌的位置滴加氧化酶试剂，1分钟内观察结果。结果判断：立即出现红色，继而逐渐加深为阳性（盐酸四甲基对苯二胺呈现蓝紫色为阳性），不变色为阴性。第17页，共46页，2023年，2月20日，星期四意义：

本试验应用广泛，如奈瑟菌属、假单胞菌属、莫拉菌属呈阳性，肠杆菌科细菌呈阴性。2、触酶试验：第18页，共46页，2023年，2月20日，星期四六、生化鉴定：将1#、2#、3#标本分别接种于KIA、、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水中，置35℃培养18～24小时。第19页，共46页，2023年，2月20日，星期四1、KIA（克氏双糖铁）试验：原理1、营养非常丰富2、葡萄糖：乳糖＝1：103、指示剂为酚红：变色范围6.0～8.6，

pH<6.0黄色，pH>8.6显红色4、含有硫代硫酸钠5、含有Fe2＋方法：直接观察结果。第20页，共46页，2023年，2月20日，星期四21只分解葡萄糖分解葡萄糖和乳糖产生气体产生H2S

结果判断第21页，共46页，2023年，2月20日，星期四22第22页，共46页，2023年，2月20日，星期四结果表示：

不产酸－，产酸＋，产酸产气⊕产酸A,产碱K

斜面/底层H2S斜面/底层H2S产气

＋/⊕－

A/

A

－

＋

－/⊕＋K/

A

＋＋第23页，共46页，2023年，2月20日，星期四242、吲哚（靛基质）试验:原理：色氨酸色氨酸酶吲哚、丙酮酸和氨对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚吲哚＋第24页，共46页，2023年，2月20日，星期四25方法:结果:

应用：用于肠杆菌科细菌的鉴定。第25页，共46页，2023年，2月20日，星期四263、甲基红试验（MR试验）

4、VP试验

第26页，共46页，2023年，2月20日，星期四27原理：变色范围4.4～6.2第27页，共46页，2023年，2月20日，星期四28方法及结果：第28页，共46页，2023年，2月20日，星期四29甲基红实验结果阴性阳性第29页，共46页，2023年，2月20日，星期四30VP实验结果阳性阴性第30页，共46页，2023年，2月20日，星期四31应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

MRVP

大肠埃希菌

＋

－产气肠杆菌

－

＋

第31页，共46页，2023年，2月20日，星期四32※

IMViCI:吲哚试验M:甲基红试验V:V-P试验C:枸橼酸盐利用试验实验

第32页，共46页，2023年，2月20日，星期四33

5、枸橼酸盐利用试验

原理：

某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠作为唯一的碳源而获得能量，能利用枸橼酸盐的细菌也能利用铵盐作为唯一氮源，同时产生氨。分解枸橼酸盐使培养基变碱性。方法：直接观察结果。应用：肠杆菌科细菌的鉴定第33页，共46页，2023年，2月20日，星期四34第34页，共46页，2023年，2月20日，星期四356、尿素酶试验

原理：产生尿素酶的细菌，分解培养基中的尿素，产生碳酸铵是培养基pH，酚红由浅红色变成深红色。第35页，共46页，2023年，2月20日，星期四36方法：直接观察结果。

结果：反应时间因细菌而异。培养基变成深红色为阳性。

应用：肠杆菌科细菌的鉴定。第36页，共46页，2023年，2月20日，星期四377、苯丙氨酸脱氨酶试验：

原理：第37页，共46页，2023年，2月20日，星期四38方法：待检菌大量接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，培养后在斜面上直接加4～5滴10％氯化铁试剂，出现绿色为阳性，立即观察，为可逆反应。第38页，共46页，2023年，2月20日，星期四39第39页，共46页，2023年，2月20日，星期四408、硝酸盐还原试验：原理：有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐与硝酸盐还原试剂中的醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸与α-萘胺结合成红色的N-α-萘胺偶氮苯磺酸。方法：在硝酸盐蛋白胨水培养物中分别滴加硝酸盐还原试剂甲液和乙液各1～2滴，混匀，立即观察结果。

第40页，共46页，2023年，2月20日，星期四41阳性：加入试剂后30s变成红色，表明有亚硝酸盐存在，表示硝酸盐还原试验阳性。阴性：加入试剂后没有颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原(真阴性反应)；②硝酸盐被还原成非亚硝酸盐的其他产物，如NH3、N2(脱硝作用)、NO或N2O