DB32T 4000-2021牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外ELISA法）

ICS11.220SB江DB32苏省地方标准DBT4000—2021DiagnosticTechniqueforBovineTuberculosisbyInterferon-gammaELISAAssay江苏省市场监督管理局发布 前言学提出。江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。草单位：扬州大学、江苏省动物疫病预防控制中心。牛结核病诊断技术(γ-干扰素体外ELISA法)干扰素体外ELISA法)的试剂及仪器、检测方法、质量控制和结核病诊断。规范性引用文件，GBT645动物结核病诊断技术GB489实验室生物安全通用要求GBT945牛结核病诊断体外检测γ干扰素法语和定义4原理T枝杆菌致敏并产生免疫记忆。当体外再次遇到牛分枝染的牛则不会分泌或低水平分泌γ-干扰素。通过双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性仪器试剂仪器见附录C。检测方法试剂配制剂的配制见附录D。样品采集与处理L型PPD溶液(可参考表1)，用微量振荡器低速充分振荡，使刺激抗原与抗凝血完全混合。培养箱中孵育16h~24h。入红细胞。细胞培养板(竖排放置)BSBSBSBSBSBSBSBSBSBSBSBSBSBSBSBS酶联免疫吸附试验50L酶标inOD450nm。操作注意事项存6个月。贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。应在样品架上标记日期、操作者的首字母、相关信息。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。6.4.3除酶标抗体外，试剂盒使用前各组份应平衡至室温，使用后即放回2℃~8℃。底物显色液避免暴露于强光和接触氧化剂。6.4.7抗体包被酶标板拆封后应避免受潮或沾水(每次将剩余的抗体包被酶标板用封口袋扎紧后尽快置应时间一致。.10严格按照操作说明书要求进行，操作过程中移液、定时和洗涤等过程应精确。质量控制m阳性对照OD450nm值范围为0.7~3.0。8结果判定标准GBT45和GB19489执行。附录A(资料性)凝血培养所需材料A.1肝素锂或肝素钠真空抗凝管；LA.4牛型PPD溶液(2.5mL/瓶)；A.5禽型PPD溶液(2.5mL/瓶)；(资料性)B.1酶标板(包被牛γ-干扰素单克隆抗体，含0.1%ProClin300)；B.5PBST洗涤液(20×)(含0.1%ProClin300)；B.6酶标抗体(含0.1%ProClin300)；B.7酶标抗体稀释液(含0.01%的硫柳汞)；B.8底物显色液(TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液)；B.9终止液(0.5MH2SO4)；B.10灭菌纯水(用于溶解阳性对照、阴性对照冻干粉)；B.11蒸馏水(用于稀释洗液)；B.12酶联免疫吸附试验所需的试剂、反应槽、封板膜和枪头。(资料性)需仪器C37℃湿温培养箱；C.2精密可调移液器(100µL、1000µL)；C.512道移液器(50µL~300µL)；C.6微量振荡器(可选)；C机(可选)；C37℃水浴锅；C.9酶标仪(含450nm滤光片)。(规范性)所用试剂的配制D.1刺激抗原D.2酶标板D.3阳性对照和阴性对照mL应保证完全溶解，溶解的阳性对照、阴性对照℃~8℃可储存1个月，但再次使用前应恢复至室温并充分混匀。D.4样品稀释液D.5酶标抗体和酶标抗体稀释液酶标抗体必须一直保存于2℃~8℃。酶标抗体稀释