发酵学灭菌演示文稿

发酵学灭菌演示文稿现在是1页\一共有77页\编辑于星期四发酵学灭菌现在是2页\一共有77页\编辑于星期四灭菌指用化学的或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的有生命的有机体的技术或工艺过程。消毒除菌现在是3页\一共有77页\编辑于星期四发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品现在是4页\一共有77页\编辑于星期四污染杂菌的危害

1.消耗营养物质。2.抑制发酵菌生长。3.改变培养液理化性质。4.抑制产物生物合成。5.噬菌体污染。现在是5页\一共有77页\编辑于星期四第一节灭菌的基本原理第二节培养基和发酵设备的灭菌第三节空气除菌第四节无菌检查与染菌处理第五节制服染菌的要点现在是6页\一共有77页\编辑于星期四一、高温湿热灭菌二、过滤介质除菌三、其他灭菌方法高温干热灭菌化学物质消毒和灭菌臭氧灭菌辐射灭菌静电除菌第一节灭菌的基本原理现在是7页\一共有77页\编辑于星期四原理：

由于蒸汽具有很强的穿透力，冷凝时可释放出大量潜热，使微生物细胞中的原生质体胶体和酶蛋白变性凝固，核酸分子的氢键破坏，使微生物死亡。常用方法：水煮常压灭菌：100℃，40-60min

高压蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟特点

蒸汽穿透力强，灭菌易于彻底；蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒一、高温湿热灭菌（一）概述现在是8页\一共有77页\编辑于星期四（二）湿热灭菌的理论基础

1.微生物的热阻大多数微生物最适温度为25~40℃,维持温度为5~50℃，当温度超过最高限温时微生物就会发生死亡。无芽孢菌在60℃保温10min即可全部被杀死。芽孢要在100℃下保温10min到几小时才能被杀死。嗜热细菌在120℃下仍可耐受20~30min。一、高温湿热灭菌现在是9页\一共有77页\编辑于星期四热阻：指微生物在某一种特定条件下（主要是温度和加热方式）的致死时间，它代表了微生物对热的抵抗能力。相对热阻：是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。致死温度：杀死微生物的极限温度称为致死温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。现在是10页\一共有77页\编辑于星期四一般所指的灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。现在是11页\一共有77页\编辑于星期四2.微生物的热灭死定律——对数残留定律实际设计时常用Nt＝0.001即1000批次的灭菌中只有一批失败。对数残留定律：在灭菌过程中，微生物个数减少速率(dN/dt)与一瞬间残留的活菌数成正比。现在是12页\一共有77页\编辑于星期四k是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据相同灭菌条件下，不同微生物的k值是不同的。k值越小，热阻越大。同一微生物在不同温度下，K值不同。温度越高，k值越大，灭菌时间越短3.反应速率常数k现在是13页\一共有77页\编辑于星期四原理：利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的。方法:0.01~0.45m孔径滤膜，使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。二、介质过滤除菌（一）概述现在是14页\一共有77页\编辑于星期四滤材孔空气过滤除菌：利用有孔介质从气体中除去微生物洁净气体含微生物的气体（二）介质过滤除菌机理二、介质过滤除菌现在是15页\一共有77页\编辑于星期四过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子，过滤/分离是在一个平面上进行的。现在是16页\一共有77页\编辑于星期四实际上，空气过滤器的滤材具有深度：“弯曲通道”的结果对于污染物的去除起到了辅助作用。现在是17页\一共有77页\编辑于星期四原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性冲击、阻截、扩散、重力沉降和静电吸附等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。现在是18页\一共有77页\编辑于星期四惯性冲击当流体改变运动方向时，惯性使颗粒撞击到滤材表面并由于吸附力而停留现在是19页\一共有77页\编辑于星期四直接拦截绝对截留

-颗粒被捕获在滤材纤维之间形成的孔中现在是20页\一共有77页\编辑于星期四扩散拦截被随机运动的气体分子碰撞的颗粒撞击到过滤介质上并被吸附截留现在是21页\一共有77页\编辑于星期四过滤机理总结直接拦截惯性冲击扩散拦截现在是22页\一共有77页\编辑于星期四三、其他灭菌方法在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，是微生物的致死率迅速增高的过程。常用方法：灼烧和电热箱加热，160℃2h使用范围：需要保持干燥的器械、容器的灭菌。玻璃及金属用具及沙土管灭菌1.高温干热灭菌现在是23页\一共有77页\编辑于星期四利用化学试剂（甲醛、苯酚、高锰酸钾等）与微生物细胞中某种化学成分反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等杀灭微生物。

应用：实验室和无菌室的空间灭菌，设备、器械、双手的消毒灭菌，但不能用于培养基的灭菌。三、其他灭菌方法2.化学物质灭菌现在是24页\一共有77页\编辑于星期四化学物质名称有效浓度化学物质名称有效浓度新洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛37%杜灭芬0.25%戊二醛2%高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）1%—5%

常用的灭菌剂现在是25页\一共有77页\编辑于星期四臭氧在常温常压下不稳定、分解为O2和O，O对细菌有极强的氧化作用。臭氧氧化分解细菌细胞内氧化葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏细胞膜，将细菌杀死。无污染消毒剂应用：洁净室、净化设备三、其他灭菌方法3.臭氧灭菌现在是26页\一共有77页\编辑于星期四

4.辐射灭菌

利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物常用：紫外线、X射线和γ射线紫外线：诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制，导致菌体死亡。波长为260nm的杀菌力最强、穿透力差。应用：适于表面灭菌。无菌室、接种箱

三、其他灭菌方法现在是27页\一共有77页\编辑于星期四原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。特点：阻力小，约1×105Pa；耗电少；除水、除油的效果好。设备庞大，高压电技术。应用：净化空气三、其他灭菌方法5.静电除菌现在是28页\一共有77页\编辑于星期四一、温度和时间对培养基灭菌的影响二、影响培养基灭菌的其他因素三、培养基的灭菌方法四、发酵设备的灭菌第二节培养基和发酵设备的灭菌现在是29页\一共有77页\编辑于星期四一、温度和时间对培养基灭菌的影响绝大多数培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都属于一级动力学反应。第二节培养基和发酵设备的灭菌微生物营养成分反应速度常数增加的倍数阿累尼乌斯方程现在是30页\一共有77页\编辑于星期四随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。Q10：温度升高10℃时的反应速度常数与原温度时的反应速度常数的比值。一般的化学反应Q10为：1.5~2.1杀灭微生物营养体的反应Q10为：5~10杀死芽孢时的反应Q10为：35微生物营养成分

芽孢VB2118℃,15min99.99%10%120℃,1.5min99.99%5%现在是31页\一共有77页\编辑于星期四培养基的成分pH培养基的物理状态泡沫培养基中的微生物数量二、影响培养基灭菌的其他因素现在是32页\一共有77页\编辑于星期四三、培养基灭菌方法实验室：工业上：分批灭菌、连续灭菌现在是33页\一共有77页\编辑于星期四（一）分批灭菌将配制好的培养基输入发酵罐中，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。现在是34页\一共有77页\编辑于星期四1．操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。（预热）保温维持：在灭菌温度（120℃）下保持30分钟。冷却保压：把培养基的温度快速降低到接种的温度。现在是35页\一共有77页\编辑于星期四三路进汽：蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气2、分批灭菌设备示意图现在是36页\一共有77页\编辑于星期四优点：不需要其他附属设备，操作简便缺点：加热和冷却时间较长，营养成分有损失；不能采用高温快速灭菌工艺；罐利用率低。现在是37页\一共有77页\编辑于星期四（二）连续灭菌培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。现在是38页\一共有77页\编辑于星期四

1.由热交换器组成的连续灭菌系统新鲜培养基第一个热交换器（残热回收器）20~30s,90~120℃第二个热交换器（加热器）140℃,30~120s第三个热交换器（冷却器）20~30s含淀粉培养基须用酸或酶水解后再用连续灭菌1mm悬浮颗粒须增加1s，1cm须增加100s，所以培养基中颗粒＜2mm发酵罐现在是39页\一共有77页\编辑于星期四现在是40页\一共有77页\编辑于星期四

2.蒸汽直接加热培养基的连续灭菌系统新鲜培养基加热器直接蒸汽加热140℃残热回收预热器回收热能由于冷凝，培养基被稀释，引起粘度的变化。发酵罐热交换器冷却现在是41页\一共有77页\编辑于星期四

3.由连消塔、维持罐和冷却器组成的连续灭菌系统控制培养基输入连消塔的速度＜0.1m/min，灭菌温度为132℃，在塔内的停留时间为20-30秒。现在是42页\一共有77页\编辑于星期四优点：

1.可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏少。

2.发酵罐非生产占用时间少，容积利用率高。

3.自动化，热能利用率合理。缺点：

1.不适用于粘度大和固形物含量高的培养基。

2.增加设备、操作环节以及染菌机率。现在是43页\一共有77页\编辑于星期四注：高温对培养基成分的有害影响现在是44页\一共有77页\编辑于星期四消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌现在是45页\一共有77页\编辑于星期四三、发酵设备的灭菌实罐灭菌：发酵罐与培养基一起灭菌；连续灭菌：发酵罐在培养基灭菌之前，直接用蒸汽进行灭菌.空消之后不能立即冷却；发酵罐附属设备灭菌：分空气过滤器、补料系统、消沫剂系统等现在是46页\一共有77页\编辑于星期四一、概述二、空气过滤介质三、空气过滤除菌的工艺流程第三节空气除菌现在是47页\一共有77页\编辑于星期四1.无菌空气的概念通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。一、概述现在是48页\一共有77页\编辑于星期四2.发酵对空气无菌程度的要求

一般要求经过滤后空气的无菌程度为N=10-3空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒)含量一般为103~104个／米3。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.6~1μm）。现在是49页\一共有77页\编辑于星期四加热灭菌(蒸汽、电能、空气压缩）3.空气除菌的方法介质过滤除菌辐射灭菌化学灭菌静电除菌现在是50页\一共有77页\编辑于星期四棉花活性炭过滤器平板式超细纤维过滤器金属烧结管过滤器微孔膜过滤器二、空气过滤介质

除菌效率高、能耐受高温高压、不易被油水污染、阻力小、成本低、易更换。现在是51页\一共有77页\编辑于星期四现在是52页\一共有77页\编辑于星期四子弹状膜过滤现在是53页\一共有77页\编辑于星期四三、空气过滤除菌的工艺流程

１——粗过滤器２——压缩机３——贮罐４——冷却器

５——丝网分离器６——过滤器

1.冷热空气直接混合式空气过滤除菌流程适用于中等混合量的地区。现在是54页\一共有77页\编辑于星期四流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热。（常用）2.两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程现在是55页\一共有77页\编辑于星期四旋风分离器——利用离心力进行沉降，对于10m以上的微粒分离效率较高。丝网分离器——利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去2～5m的细小颗粒。现在是56页\一共有77页\编辑于星期四特点：无菌程度高3.高效前置过滤除菌流程现在是57页\一共有77页\编辑于星期四注.空气的预处理提高压缩前空气的洁净度去除压缩后空气中的油和水冷却现在是58页\一共有77页\编辑于星期四1）提高压缩前空气的洁净度提高空气吸气口的位置在空气入口处设置粗过滤器

——捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机现在是59页\一共有77页\编辑于星期四高空取气管

为远离地面几十米的管子。每升高3.05米，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。

现在是60页\一共有77页\编辑于星期四2）去除压缩后空气中的油和水3）压缩后空气温度显著上升，需冷却压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧增大发酵罐的降温负荷增加培养液水分的蒸发分离器储气罐中除去大的水滴和油滴现在是61页\一共有77页\编辑于星期四一、无菌检查二、染菌的处理第四节无菌检查与染菌处理现在是62页\一共有77页\编辑于星期四一、无菌检查培养试验：平板培养、肉汤培养显微镜检查培养液的生化指标变化（一）无菌检查方法现在是63页\一共有77页\编辑于星期四1.无菌试验连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或浑浊。平板上连续3个时间样品长出杂菌检查样品保留，以备长期监测。一般保留至放罐后12小时。（二）染菌的判断现在是64页\一共有77页\编辑于星期四2.溶解氧水平异常变化显示染菌发酵时间溶氧浓度正常发酵污染噬菌体发酵时间溶氧浓度正常发酵污染好气性杂菌污染非好气性杂菌现在是65页\一共有77页\编辑于星期四3.排气中CO2异常变化显示染菌工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少现在是66页\一共有77页\编辑于星期四二、染菌后的处理1.种子罐染菌的处理直接灭菌后废弃（一）污染杂菌的处理

现在是67页\一共有77页\编辑于星期四危害性大,采用蒸汽灭菌经过滤处理后放掉如果危害性不大,可用重新灭菌、重新接种2.发酵罐染菌的处理（一）污染杂菌的处理

前期染菌中后期染菌加入适量的灭菌剂（抗生素）降低培养温度控制补料量来控制杂菌的生长速度二、染菌后的处理现在是68页\一共有77页\编辑于星期四3.染菌后设备的处理用甲醛等化学物质处理,再用蒸汽灭菌〈包括各种附属设备〉。在再次投料之前,要彻底清洗罐体、附件,同时进行严密程度检查,以防渗漏。

（一）污染杂菌的处理

二、染菌后的处理现在是69页\一共有77页\编辑于星期四（二）污染噬箘体的处理1.污染噬菌体的判断噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀在较短时间内菌体大量自溶,最后仅残留菌丝断片平皿培养出现典型的噬菌斑溶氧浓度回升提前营养成分很少消耗,产物合成停止等现象。有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验二、染菌后的处理现在是70页\一共有77页\编辑于星期四1）发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失；2）全部停产,对环境进行全面的清洗和消毒,断绝噬菌体的寄生基础；3）更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体菌种,防止噬菌体的重复污染。2.污染噬菌体的处理办法

二、染菌后的处理（二