血浆蛋白质与含氮化合物生物化学检验

血浆蛋白质与含氮化合物的生物化学检验1临床检验教研室龚晓华第一页，共67页。本章内容概要：第二节氨基酸代谢紊乱的生物化学检验第一节血浆蛋白质的生物化学检验2第三节嘌呤核苷酸代谢紊乱的生物化学检验第二页，共67页。1、掌握急性时相反应蛋白的概念及临床意义；重要血浆蛋白质的测定方法、参考值和临床意义；嘌呤核苷酸代谢紊乱—高尿酸血症及痛风2、熟悉血清蛋白电泳图谱与异常带型、血浆蛋白质的理化性质和功能3、了解氨基酸代谢紊乱、血清特定蛋白质的检测方法本章教学要求：3第三页，共67页。第一节血浆蛋白质的生物化学检验机体蛋白质：体液蛋白质的检测：机体主要的生物大分子含量：人体固体成分的45%种类：10万，3000~5000种/单细胞功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等疾病发生体液蛋白质异常4第四页，共67页。要判断异常首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能，分类及特点一、血浆蛋白质的组成、功能及分类组成：种类：1000种已研究500种已分离200种含量：μgmgg来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂5第五页，共67页。功能：①营养作用，修补组织蛋白;②维持血浆胶体渗透压③作为PH缓冲系统的一部分④作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体；⑤体液免疫防御系统⑥催化作用⑦代谢调控作用⑧参与凝血与纤维蛋白溶解6第六页，共67页。分类：依据来源、分离方法和生理功能来源肝生成：绝大多数血浆蛋白质其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素7第七页，共67页。分离方法盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）电泳法：醋酸纤维素薄膜电泳：6种琼脂糖凝胶电泳：13种聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种分辨率增高--+醋酸纤维素薄膜8第八页，共67页。9功能分类:第九页，共67页。10二、重要的血浆蛋白质和血清蛋白质电泳正常血清蛋白电泳图谱示意图及其扫描曲线第十页，共67页。11血浆蛋白质的性质功能及其与电泳区带的关系第十一页，共67页。12异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征第十二页，共67页。13

A正常人B肾病综合征C肝硬化(β-γ桥)D肝硬化(不典型β-γ桥)

E多发性骨髓瘤IgA型F多发性骨髓瘤IgG型典型异常血清蛋白电泳图谱第十三页，共67页。14正常血清蛋白电泳上显示的宽γ区带主要成分:免疫球蛋白(Ig)。浆细胞病（plasmacelldyscrasia）：异常浆细胞增殖，产生大量单克隆Ig或其轻链或重链片段，病人血清或尿液中可出现结构单一的M蛋白（monoclonalprotein）在蛋白电泳时呈现一个色泽深染的窄区带，此区带较多出现在γ或β区，偶见于α区。浆细胞病与M蛋白

第十四页，共67页。15三、急性时相反应蛋白

急性的全身或系统性炎症包括感染、组织损伤（如创伤、手术、心肌梗死、恶性肿瘤等）、炎症性疾病（如自身免疫性炎症）等情况下，肝脏对多种血浆蛋白质合成量发生变化，可有明显的升高或降低，这些变化的血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白（APRs），增加的蛋白质称为正向APRs，下降的蛋白质称为负向APRs。第十五页，共67页。16正向APRs

CRPPCTSAAAAGAATHp

C4Fg(FIB)C3Cp

PAAlbTRF负向APRs第十六页，共67页。急性时相反应机制：当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导致肝细胞中上述蛋白质的合成增加或减少。急性时相反应的应用：急性时相反应时,血浆蛋白质的变化和创伤的时间进程有关，可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理状态。17第十七页，共67页。18四、血浆中几种主要蛋白质（一）血清总蛋白（TP）

血清总蛋白是血浆中所有蛋白质含量的总体反映，与肝脏合成蛋白质功能及免疫球蛋白合成情况有关，尤其是结合血清白蛋白浓度，能大概反映免疫球蛋白的含量。参考值成人：65～85g／L

第十八页，共67页。191.凯氏定氮法－参考方法2.双缩脲法(最好)3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6.UV法测定方法第十九页，共67页。1.凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mgN0.3gpro)消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）

蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；

吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+]

）滴定用已标定的无机酸滴（使[H+]恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比。

原理：20第二十页，共67页。评价：优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。

应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法21第二十一页，共67页。2.双缩脲法原理：蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。

双缩脲生成

加热＋NH322H－180022222N端C端22第二十二页，共67页。评价：优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%＜2%，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。

应用：常规推荐方法。手工或上机使用。23第二十三页，共67页。3.酚试剂法原理：蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，

Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。24第二十四页，共67页。评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。

25第二十五页，共67页。4.比浊法原理：

评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）

某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。26第二十六页，共67页。5.染料结合法在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。原理：常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等评价及应用：优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。

27第二十七页，共67页。6.紫外分光光度法

蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

（2）Warburg-Christian公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260

原理：28第二十八页，共67页。评价及应用：优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。29第二十九页，共67页。结构：也称白蛋白，585个aa残基构成的单链多肽，MW=66458，含17个二硫键。理化性质：pI=4－5.8，肝细胞合成但不储存，半衰期为15-19天，占总蛋白的40%－60%，pＨ7.4时带负电。测定方法：色素结合法:溴甲酚绿（BCG），溴甲酚紫（BCP）,盐析等。（二）清蛋白（ALB）

急性时相反应蛋白

30参考值成人：40～55g／L

第三十页，共67页。临床意义：白蛋白升高：白蛋白降低：肝功能下降：慢性肝病白蛋白丢失：由尿中、胃肠道、皮肤丢失白蛋白分解代谢增加：组织损伤及组织分解增加白蛋白分布异常：肝硬化等先天性ALB缺乏病：极少见的遗传性疾病蛋白质营养不良或吸收不良的评价指标真性升高：未见假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白31第三十一页，共67页。32＞35g/L正常28～34g/L轻度缺乏21～27g/L中度缺乏＜21g/L严重缺乏低于28g/L时会出现组织水肿血浆Alb作为营养指标的评价标准第三十二页，共67页。方法：间接法:TP-ALB=GLB直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量)色氨酸+乙醛酸紫色化合物H+Hopkins-Cole反应:

成人20－40g/L.A/G：1.2－2.433球蛋白（GLB）参考值第三十三页，共67页。临床意义：球蛋白升高：球蛋白降低：合成减少、低或无γ-球蛋白血症

真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反应、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症。假性升高（少见）：机体明显失水。34第三十四页，共67页。结构：MW=54000，四个相同亚基构成的四聚体。理化性质：pＩ＝4.7，肝细胞合成，半寿期12小时。测定方法：免疫比浊法／免疫扩散技术。（三）前白蛋白（PA，TTR）急性时相反应蛋白

35即甲状腺素转运蛋白（TTR），50%--70%的TTR与视黄醇结合蛋白（RBP）组成复合体，由于TTR电泳位置在白蛋白之前故命其为PA。TTR和RBP均由肝脏合成，为运载和营养蛋白。第三十五页，共67页。功能：营养指标，载体功能（甲状腺素／维生素Ａ）。参考值：0.2—0.4g/L临床意义：PA下降是肝功能不全的灵敏指标；降低：营养不良，急性炎症，恶性肿瘤，肝硬化及肾炎时。36第三十六页，共67页。结构：394个aa残基构成的单链多肽，含10％～12%的糖MW=5.5万。也称丝氨酸蛋白酶抑制物。理化性质：pI值为4.8，占α1-球蛋白区带显色的90％。测定方法：免疫化学法，电泳（酸性凝胶电泳或等电聚焦电泳），利用蛋白酶抑制能力测定等。功能：蛋白酶抑制物（具有90％的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，弹性蛋白酶，但此抑制作用有明显的pＨ依赖性。（四）α1-抗胰蛋白酶（AAT）

急性时相反应蛋白

37第三十七页，共67页。38常染色体共显性遗传，有多种遗传表型现已发现至少有75种基因变体主要根据电泳迁移率分类移动快的AAT变体用字母表前面的字母表示，移动最慢的基因以PiZ表示。F型--fast,M型--middle,S型—slow具有正常功能的是PiMM型，最常见的缺陷变体为Z和S型，表现为以下基因型：ZZ、SS、SZ、MZ、MS。ATT基因的遗传表型

第三十八页，共67页。降低：（1）见于AAT缺陷：PiZZ型、PiSS型甚至PiMS型常伴有早年（20～30岁）出现的肺气肿低血浆AAT可发现于胎儿呼吸窘迫综合征ZZ蛋白聚集在肝细胞，导致肝硬化PiZZ表型的新生儿中10%～20%在出生数周后易患肝炎，最后因活动性肝硬化致死PiZZ表型的某些成人会发生肝损害（2）肾病综合征，胃肠道疾病升高：AAT属急性时相蛋白，在炎症、感染、肿瘤、肝病时均显著增加。39参考值：0.9－2.0g/L临床意义：第三十九页，共67页。40应用评价：

慢性阻塞性肺疾病全球计划推荐，具有家族病史且45岁前发病的慢性阻塞性肺病患者，需要检测ATT。α1蛋白区带的显色成分主要是ATT，若α1区带减少，建议进行ATT定量检测。AAT<0.7g/L应做ATT基因型检测，PiZZ型通常在。美国食品和药品管理局推荐当<0.56g/L时采用每周输注一次ATT的替代治疗。第四十页，共67页。结构：181个aa残基构成的单链多肽，MW=3.5-4万，含45%的糖，其中唾液酸占11%－12%。理化性质：pI值2.7－3.5，肝细胞合成，脓毒症时粒细胞和单核细胞及某些肿瘤组织也可合成。位于α1-球蛋白区带。测定方法：免疫化学法（扩散,浊度）,化学法（间接法），ELISA法等（五）α1-酸性糖蛋白（AAG）

急性时相反应蛋白

41第四十一页，共67页。功能：与免疫防御功能有关，机制不详；抑制血小板凝集影响胶原纤维形成；参与脂类运输。参考值：０.5－1.2g/L。42第四十二页，共67页。临床意义：AAG增高（1）急性时相反应指标：在风湿病、恶性肿瘤及心肌梗死等炎症或组织坏死时一般增加3～4倍。AAG增高是活动性溃疡性结肠炎最可靠的指标之一。（2）糖皮质激素增加，包括内源性的库欣综合征和外源性强的松、地塞米松等药物治疗时，AAG降低：（1）营养不良、严重肝损害、肾病综合征以及胃肠道疾病致蛋白严重丢失等（2）雌激素可使AAG降低。43第四十三页，共67页。结构：分子量720KDa,是血浆中最大的蛋白质，由四个相同的亚基组成，含糖量约８％。理化性质：肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，半寿期5天。测定方法：免疫化学等功能：与多种分子和离子结合，影响蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制剂,具有选择性保护某些酶的作用）。（六）α2-巨球蛋白(AMG)

44第四十四页，共67页。参考值：临床意义：婴幼儿及儿童比成人高；升高：见于慢性肾炎、肝疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等，雌激素，低蛋白血症可使其含量升高；降低：胰腺炎及前列腺癌时。45第四十五页，共67页。结构：

两对肽链形成四聚体，有三种不同的表型，即Hp1(1-1)、Hp2-1、Hp2(2-2)，分子量在85-400KD理化性质：肝合成，pI值为4.1，电泳位a2-球蛋白区带测定方法：电泳法，免疫化学法（扩散,浊度）,化学法等（七）结合珠蛋白(Hp)

急性时相反应蛋白

46参考值：0.3-2.0g/L第四十六页，共67页。功能：与红细胞中释出自由Hb结合,防止Hb从尿中丢失而为机体有效地保存铁,急性溶血后一周再生恢复。临床意义：Hp浓度下降见于：①溶血性疾病如溶血性贫血、输血反应、疟疾。对于溶血性疾病合适的组合检测项目包括血浆Hp、LD和游离Hb。血管外溶血不会使Hp发生变化。②严重肝病患者，其Hp合成减少。Hp浓度升高见于：属急性时相反应蛋白，当烧伤和肾病综合征情况下，血Hp常明显升高。47第四十七页，共67页。结构：

MW=12-16万,1046个aa残基构成的单链多肽，含糖约１０％，每分子铜蓝蛋白可结合６～８个铜原子。理化性质：肝合成,巨噬细胞和淋巴细胞合成少量；pI值为4.4，具遗传基因多态性。测定方法：免疫化学（扩散或比浊）等（八）铜蓝蛋白(CER)

急性时相反应蛋白

48第四十八页，共67页。功能：具铁氧化酶活性且起抗氧化剂作用，铜的无毒代谢库临床意义：增加—感染,创伤,肿瘤;降低--营养不良，严重肝病及肾综;协助诊断Wilson病49参考值：L第四十九页，共67页。结构：MW=7.7万,单链糖蛋白，含糖约６％。理化性质：肝细胞合成，pI值为5.5-5.9,半寿期10.5天，可逆结合多价离子如Fe,Cu,Zn,Co等，一分子TRF可结合两个三价铁。测定方法：免疫扩散法，放免法和免疫比浊法等。（九）转铁蛋白(TRF)

急性时相反应蛋白50第五十页，共67页。功能：运输铁。临床意义：血TRF浓度受铁供应调节，缺铁TRF升高，铁治疗后恢复。可用于贫血的诊断和对治疗的监测。降低:急性时相反应、慢性肝病、营养不良及蛋白丢失时；升高：妊娠或雌激素会使其升高;缺铁性贫血。51参考值：

第五十一页，共67页。结构：

MW=11800，100个aa残基构成的单链多肽，分子中含一对二硫键，不含糖。理化性质：

pI值为5.7，存在于各种有核细胞表面，可从淋巴和肿瘤细胞表面释放入血循环。半衰期107分钟，几乎由肾小管回收。测定方法：放射免疫化学等。

（十）β2－微球蛋白(BMG)

52第五十二页，共67页。功能：分子量小，可自由通过肾小球滤过膜，在肾小管几乎全部重吸收，可监测肾小管功能；是HLAβ链的轻链部分。临床意义：增高：肾功能衰竭，炎症及肿瘤时。53参考值：1.0—2.0mg/L第五十三页，共67页。结构：

MW11.5-14万，分子含５个相同的亚基，亚基间靠非共价键连接成圆盘状多聚体。理化性质：肝合成，pI值为6.2，电泳位于r区带。测定方法：半定量沉淀法（早），免疫化学法、放免法。

（十一）C-反应蛋白质(CRP)

急性时相反应蛋白

54第五十四页，共67页。功能：结合多糖，磷脂和核酸；激活补体，抗凝。参考值：＜5mg/L

临床意义：第一个认定的急性时相反应蛋白,是急性时相反应的一个敏感指标，在ＡＭＩ、创伤、感染、外科手术时含量迅速升高，达到正常的2000倍。55第五十五页，共67页。CRP是非特异性指标，主要用于结合临床监测疾病①筛选微生物感染②评估炎症性疾病的活动度和疗效监控③识别系统性红斑狼疮、白血病和外科手术后并发的感染④监测肾移植后的排斥反应⑤新生儿败血症和脑膜炎的监测56第五十六页，共67页。57（十二）降钙素原(PCT)急性时相反应蛋白PCT为116个氨基酸的多肽，是由甲状腺C细胞分泌的降钙素的前体。炎症反应时，其他组织如肝、肾、胰腺也合成降钙素原，并且不进行裂解，使其血浆浓度从一个非常低的基线浓度迅速增加，增加速度远高于其他APRs。细菌感染后3h可发生PCT水平的升高，6-12h达峰值，体内半衰期24h。第五十七页，共67页。58（十二）降钙素原(PCT)急性时相反应蛋白临床应用：病毒感染即使在严重的病毒性疾病中，PCT也不会升高。PCT浓度的升高仅见于在合并细菌重复感染或脓毒症PCT浓度的升高标志着炎症反应的加重，暗示预后不良并为持续存在脓毒症病灶的一个线索。PCT浓度下降则表明炎症反应逐步消失，如潜在传染性病灶的成功治疗和脓毒症感染的控制。第五十八页，共67页。59临床意义：1、全身感染/脓毒血症的鉴别诊断PCT<0.05ng/mL健康人0.05≤PCT≤0.5ng/mL进展为重度全身感染/脓毒症的风险为低度

0.5≤PCT<2.0ng/mL中度风险

2.0≤PCT<10.0ng/mL高度风险PCT≥10.0可确诊为脓血症或脓毒症休克第五十九页，共67页。60临床意义：2、下呼吸道感染的鉴别诊断PCT<0.1ng/mL排除细菌感染的可能性，强烈不推荐使用抗生素0.1≤PCT<0.25ng/mL细菌感染可能性小，不推荐使用抗生素0.25≤PCT<0.5ng/mL细菌感染可能性大，建议开始使用抗生素PCT≥0.5有细菌感染，强烈推荐使用抗生素第六十页，共67页。61（十三）血清淀粉样蛋白A(SAA)

急性时相反应蛋白

与CRP相仿，用以评估急性相反应进程。SAA是个灵敏的参数，它在炎性反应大约8h后开始升高，且超过参考范围上限时间早于CRP，但目前，少数商业化的检测方法表现出变异性，一旦WHO提供SAA参考品(目前研制正在进行中)，可比性将得到改善。参考值：＜10mg/L

第六十一页，共67页。62第二节氨基酸代谢紊乱的生物化学检验一、概述（一）体内氨基酸代谢（二）氨基酸代谢紊乱的种类1、遗传性氨基酸代谢紊乱2、继发性氨基酸代谢紊乱二、检测项目及检测方法（一）体液氨基酸过筛试验（二）体液氨基酸定量第六十二页，共67页。6