基因工程操作流程

基因工程操作流程第1页，共27页，2023年，2月20日，星期四为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensussequence)，只有少数几个核苷酸的差别。第2页，共27页，2023年，2月20日，星期四终止子第3页，共27页，2023年，2月20日，星期四能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区:非编码区:原核细胞的基因结构有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子第4页，共27页，2023年，2月20日，星期四（二）真核细胞的基因结构(补)编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子

能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：

外显子：

第5页，共27页，2023年，2月20日，星期四原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码第6页，共27页，2023年，2月20日，星期四1.2基因工程的基本操作程序①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因第7页，共27页，2023年，2月20日，星期四基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定第8页，共27页，2023年，2月20日，星期四目的基因——主要指编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子。取出DNA用限制酶切断DNA

目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的获取第9页，共27页，2023年，2月20日，星期四基因文库的种类：

基因组文库：含有一种生物所有的基因部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库）获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因基因文库（genelibrary）的概念：将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。第10页，共27页，2023年，2月20日，星期四组织或细胞染色体DNA限制性核酸内切酶DNA片段重组DNA分子含重组分子的转化菌载体受体菌基因组文库存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。第11页，共27页，2023年，2月20日，星期四mRNA逆转录酶cDNA双链cDNA重组DNA分子载体含重组分子的转化菌受体菌用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。cDNA文库第12页，共27页，2023年，2月20日，星期四文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以第13页，共27页，2023年，2月20日，星期四PCR(polymerasechainreaction)

——多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。

获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因

PCR扩增仪第14页，共27页，2023年，2月20日，星期四原理：DNA双链复制反应过程：1.变性：将反应系统加热至90℃-95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至55℃-60℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：将温度升至70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。

上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。反应体系：模板DNA、特异性引物、 耐热DNA聚合酶、dNTP及缓冲液第15页，共27页，2023年，2月20日，星期四

利用PCR技术扩增目的基因第16页，共27页，2023年，2月20日，星期四DNA合成仪过程：

适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成

获取目的基因方法三：化学合成法

第17页，共27页，2023年，2月20日，星期四小结:目的基因的获取：三种方法(1)从基因文库中获取适用于目的基因序列为未知的情况(2)利用PCR技术扩增适用于目的基因的序列为已知的情况(3)人工合成适用于目的基因不是很大且其序列是已知的第18页，共27页，2023年，2月20日，星期四基因表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因等标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2、基因表达载体的构建第19页，共27页，2023年，2月20日，星期四常用的受体细胞

动物、植物、微生物转化：

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。3、目的基因导入受体细胞第20页，共27页，2023年，2月20日，星期四1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法转化方法2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞常用CaCl2第21页，共27页，2023年，2月20日，星期四1）将目的基因导入植物细胞常用方法：---农杆菌转化法

适用范围：双子叶植物和裸子植物转化过程：第22页，共27页，2023年，2月20日，星期四1）将目的基因导入植物细胞——基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是籍高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高此技术最早由我国学者周光宇提出的，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。1）将目的基因导入植物细胞——花粉管通道法第23页，共27页，2023年，2月20日，星期四2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术第24页，共27页，2023年，2月20日，星期四3）将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌细胞的转化方法：用Ca+（常用CaCl2）处理细菌细胞，以增大细胞壁的通透性，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态细胞。将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。第25页，共27页，2023年，2月20日，星期四1)分子水平的检测检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测方法：DNA分子杂交技术检测方法：分子杂交技术检测方法：抗原