欧蒙印迹法检测ANA抗核抗体实验报告

实验1：抗ANA自身抗体得检测（欧蒙斑点法）一、 实验目得及原理抗核抗体（antinuclearantibody,ANA）就是一组针对细胞核成分得自身抗体、ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。根据细胞内各分子得理化特性与分布部位,ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体与抗其她细胞成分抗体。在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）得检测模条上平行包被了高度纯化得自身抗原。用于体外定性检测人血清或血浆中得抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A与Ro—52）、SS—B、Scl-70、PM-Scl、Jo—1）CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白与AMAM2共14种不同抗原IgG类抗体。欧蒙印迹法得实验原理如下:样本血清与包被抗原得检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中得自身抗体将与膜条相应位点上得自身抗原特异性结合、洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记得羊抗人IgG（二抗）,将与结合在膜条相应抗原位点上得自身抗体（一抗）结合，形成抗原一1stAb—2"Ab复合物。最后，加入酶底物NBT/BCIP（四卩坐硝基苯胺兰/5-漠-4-氯啶-磷酸盐）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色得化合物沉淀。二、 实验材料包被抗原得检测膜条nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS—B、Sc—70、PMScI、J0—1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白阳性对照:人IgG,100倍浓缩,1x0。02ml酶结合物:碱性磷酸酶标记得羊抗人IgG,10倍浓缩,1x3m1样本缓冲液，直接使用，1x100ml清洗缓冲液,10倍浓缩,1x50m1底物液:NBT/BCIP（四坐硝基苯胺兰/5-漠-4-氯啶一3一吲噪-磷酸盐）,直接使用,1X30m1温育盘2x8槽

三、实验步骤（一）预处理试剂盒平衡至室温30分钟后使用，取出膜条。清洗缓冲液,10倍稀释:30mL清洗缓冲液+270mLDW,50ml/支分装。+21mL样本缓冲液阳性对照+2ml样本2、1mL+18+21mL样本缓冲液阳性对照+2ml样本2、1mL+18、9mL-10mL/支，分装2支;按排一组作阳性对照:0.02m1缓冲液。AKP-羊抗人IgG,使用前10倍稀释:AKP-羊抗人IgG样本缓冲液-10mL/支，分装2支、（二） 正式处理预处理5min用镶子取出膜条，数字面朝上放入温育槽中，每槽中加入1、5ml样本缓冲液;常温摇床震荡5min。抗原与血清（1st抗体）温育30min枪头吸去槽内液体,在温育槽中分别加入lo5ml已稀释血清，常温，摇床震荡30mino清洗15min用枪头吸去槽内液体，在摇摆摇床上用lo5ml清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5mino加10X稀释得酶结合物（二抗）,抗原一抗体一羊抗人IgG（二抗）温育30min吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5ml酶结合物。常温摇床震荡30min、清洗15min用枪头吸去槽内液体，在摇摇床上用1、5m1清洗缓冲液清洗膜条3次,每次5分钟、加底物溶液，反应10min吸去槽内液体，在槽内分别加入1。5ml底物液。常温，摇床震荡10mino蒸馅水终止反应吸去槽内液体，用蒸馅水清洗3次,1、5ml/次,1/次、风干15min。（三） 判读结果•膜条干后，肉眼观察条带颜色强度;对照膜条上包被抗原位置，决定阳性抗体得种类、•质控带出现强得颜色反应说明实验操作正确。膜条包被抗原得位置上出现得白色条带应判为阴性;阳性反应在抗原包被区呈兰色或紫色条带。•抗原带着色与质控带强度相同为强阳性、中到较强为阳性、非常弱为可疑、无色为阴性。四、实验结果第8组条带如图1所示（从左至右数第一列）。结果判读示意图如图2所示。DL1590-####-8GnRNP/SmSS-ARo-52Scl-70Jo-1CENPB核辭HDL1590-####-8GnRNP/SmSS-ARo-52Scl-70Jo-1CENPB核辭H本P蛋白dsDNA核小体图1。本次实验膜条条带图2。结果示意图根据结果示意图，本次实验在质控带上出现了深紫色条带，位于从上往下数得第一区域,说明实验操作正确。本组膜条上出现强阳性得条带有三条，分别位于从上往下数得第二区域（1条）与第九区域（2条），条带呈深紫色。对照结果示意图，说明本实验所用患者血清得抗SS—A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性。膜条上出现弱阳性得条带有一条,位于从上往下数得第八区域，条带呈淡蓝色。对应结果示意图，可知本实验所用患者血清得抗SS-B抗体为弱阳性。另外，膜条从上往下数第四区域出现一条白色条带，所对应检测得抗体为抗dsDNA抗体。根据结果判读原则，应判为阴性、五、分析与讨论（一） 实验结果分析由上述结果判读发现，本实验所用患者血清得抗SS-A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性，抗SS-B抗体为弱阳性。SS-A抗原属于小核糖核酸蛋白，参与mRNA转变为有翻译活性分子。抗SS—A抗体常见于干燥综合症、（阳性率40%-80%）.系统性红斑狼疮（30%-40%）、原发性胆汁性肝硬化（10—20%）。抗Ro-52就是抗SS-A抗体得其中一类（抗SS一A包括抗Ro52与抗Ro60两种自身抗体）,常见于干燥综合征、系统性红斑狼疮。抗Ro—52如果阳性则提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提示作用。SS—B抗原就是细胞核中作为RNA多聚酶III得辅蛋白，研究表明SS-B抗原决定簇就是SS-A抗原得一部分，故SS-B抗体常伴随SS-A抗体一起出现。抗SS—B抗体几乎仅见于干燥综合症（阳性率40%-80%）与系统性红斑狼疮（10%-20%）得女性患者中。抗核糖体P蛋白抗体（ARPA）,则就是系统性红斑狼疮得特异性抗体。SLE得活动性与ARPA得效价不具有相关性，对于有中枢神经系统症状、肾炎或肝炎得SLE患者,ARPA得阳性率与整个SLE人群基本相同。因此，根据不同抗核抗体所提示得疾病，以及该患者得抗核抗体谱，初步推断该患者患有自身免疫疾病并且可能就是系统性红斑狼疮SLE）。若要明确诊断SLE,除了抗核抗体检测之外还需要根据患者得临床表现如皮肤狼疮、口鼻咽部溃疡）,就是否有肾脏、神经病变,就是否有外周白细胞或淋巴细胞减少等信息，来进一步判断。在美国风湿协会（ACR）提出得SLE分类标准中，需同时根据临床分类标准与免疫学标准作出诊断。（二） 关于实验操作及结果判读得讨论本次实验得膜条背景较浅，利于结果得判读。有资料显示，在清洗时间一定得情况下，欧蒙印迹法中使用得摇床类型对于背景颜色有所影响，优先使用垂直振荡得摇摆摇床、若使用水平振荡摇床，由于液体受力作用向两侧集中，形成典型得“哑铃状”液体分布，可能使得膜条中部得抗原与抗体反应性下降，或者膜条洗涤不充分，导致膜条背景加深，影响实验结果判读。作为核酸分子,dsDNA抗原与其她蛋白质抗原具有完全不同得带电荷能力。因此,dsDNA抗原包被得位置不易与血清样本中得其她物质结合。当样本为dsDNA阴性时，抗原包被区域反应较弱或者无反应，而同一膜片上得其它区域由于吸附少量杂质导致背景加深，从而形成dsDNA条带发白得现象、出现上述实验结果时，样本可判断为明确可靠得阴性结果。【参考资料】王莉等，抗Ro52抗体与