制备色谱应用-s1课件

人们只有将新的天然产物纯化之后才能进一步利用谱学技术鉴定其化学结构，测定其理化性质和生物活性，同时提供其作为制药原料、标准品或供做合成工作的起始原料。从一个粗提物中获得纯的化合物通常需经过许多纯化步骤，这些步骤烦琐、耗时。且花费较大。有时，所需化合物得率很低或性质不稳，因而,需要有尽可能多的分离方法以供选择。尽管有时也可能犯这样或那样的错误，但今天人们已有可能通过对各种方法进行审慎地选择来设计一条恰当的快速分离路线。

第一章样品的制备与纯化

样品的制备对于复杂的分离与纯化非常重要。恰当的样品预处理可免去后续操作过程中的许多麻烦，使分离纯化变得更为容易。无论样品是来源于混有蛋白质的生物体、生产中混有残存催化剂的工业制品，或混有干扰杂质的植物体，通过简单的预处理就可以除去其中大部分不需要的物质。样品的预处理特别适用于需要使用昂贵的制备型高压液相色谱柱时。尽管制备样品的目的不尽相同，但其中许多操作与分析型高压液相色谱中所采用的一样。当处理生物样品时问题可能更加复杂，因为样品不仅可能含有复杂的大分子，而且还可能混有前面纯化过程中残留的缓冲液、盐及洗涤剂。因此，必须在预处理中去除上述污染物以免污染高压液相色谱柱。在设计纯化方案时，通常先使用高效与低分辨率的预处理方法，其中包括一些经典的方法，如选择性溶剂提取、过滤、沉淀、透析、离心及简单的常压柱色谱分离等。而一些较新的方法，如超临界流体萃取、固相萃取等则更具有快速、高效的优点。生物分子(尤其是生物聚合体)与常见的次生代谢产物性质明显不同，需要使用特殊的预处理方法。除常用的离心、沉淀(如用硫酸铵沉淀蛋白质)、离子交换及凝胶过滤等方法(Wehr，1990)外，可用透析、超滤等专用方法。1．中药化学成分概述

成分分类生物碱有机胺类吡咯类吡啶类莨菪烷类喹啉类异喹啉类菲啶类丫啶酮类吲哚类咪唑类喹唑酮类嘌呤类甾体类帖类大环类其他类

苷类黄酮苷蒽醌苷皂苷强心苷香豆精苷挥发油有机酸蛋白质氨基酸树脂糖类鞣质一张圆滤纸可同时点上8～10个样品。样品滴好后，将一小条滤纸芯插入滤纸的中心小孔。移到盛有展开溶剂的直径为12厘米的培养皿中，滤纸芯浸在溶剂中，滤纸上再盖以同样直径的培养皿，以进行层析(如图2所示)。溶剂的前沿达到滤纸边缘后，取出滤纸，待溶剂挥发后，根据情况，喷上显色剂。如果要测定不同样品中同类成分的分布情况，则可在一张圆形滤纸上分别滴加各种中药(最多可滴加10种)的乙醇提取液，用溶剂展开后喷同一种显色剂。当欲观察一种样品中几种成分的分布情况，则可滴加10个同一种中药的乙醇提取液，经溶剂展开后，将滤纸剪为10份，分别喷以不同显色剂。三、展开溶剂以甲醇或95％乙醇为展开溶剂。可采用重蒸馏的工业规格的溶剂。四、显色剂优点是节省原料、试剂和时间，还可以防止试管反应中由中药颜色造成的假阳性。二．试管预试法1．样品制备（1）酸性乙醇提取液称取通过20目的中药粉末10g，加70ml0.5%的盐酸乙醇溶液，在水浴上回流加热10min，趁热滤过，得酸性乙醇提取液。此滤液用以检查酚性成分、有机酸和生物碱。（2）水提取液称取通过20目的中药粉末10g，加水100ml，在室温浸泡过夜，滤取10ml滤液，供检查氨基酸、多肽和蛋白质等。剩余的药渣及浸液在60℃水浴中加热10min，立即过滤，此滤液供检查糖、多糖、皂苷、苷类和鞣质等。（3）甲醇提取液称取通过20目的中药粉末10g，加入70ml甲醇，在水浴上回流加热10min，趁热滤过，滤液供检查黄酮及其苷类、蒽醌及其苷类、强心苷、香豆精及其苷类、内酯、挥发油、植物甾醇和油脂类等。（试管反应因中药颜色深，容易造成假阳性）中药化学成分系统预试法1．单项预试即直接寻找生物碱、苷、、、。2．系统预试法常用递增极性溶剂法

溶剂混溶性表中药化学成分提取基本方法2．1提取合理地选择单一或混合溶剂进行提取是保证正确的样品制备的第一步。首先以低极性溶剂提取可得到亲脂性的组分，而用醇类溶剂提取则可得到大量的极性与非极性物质。若开始阶段采用极性大的溶剂提取，则接着可用溶剂分配方法将提取物分为极性不同的部位。在提取操作的各种方法中，搅拌与机械振荡是常用的方法，此外还有渗滤或加压固液提取等手段。在加压固液提取法中，将干燥的植物装在柱中，用泵加压使提取溶剂通过柱床。Dionex公司生产的适用于该方法的一种提取装置ASE200(AcceleratedSolventExtraction)，据称每次提取只需20min．提取温度也可调至高达200℃，并可选择三种不同大小的提取器：11，22和33ml。尽管该仪器价格较高，却代表了提取技术方面的重要进步。在蛋白质的纯化过程中，提取物的制备是关键的一步，其中有些需要特别注意之处，如有时可能需要加人缓冲溶液、洗涤剂、辅因子或其他一些试剂。（1）溶剂法水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞石油醚冷浸煎煮回流渗漉连续抽提（2）水蒸气蒸馏法（3）升华法2.2.1官能团的极性(2)化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。以氨基酸来说，分子结构中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸，虽也含有如羧基这样的强极性基团，但因分子的主体乃由长链烃基所组成，故极性依然很弱。又如葡萄糖，因分子中含有许多-OH基，故为极性化合物，但鼠李糖(6-去氧糖)及加拿大麻糖(2，6-去氧糖)因分子中—CH20H及—CHOH分别脱去氧变为—CH3及—CH2，故极性即随之降低。再如，从黄花夹竹桃果仁中曾分出下列七种成分。(表1-4)。2．制备色谱用样品的制备与纯化2.1提取

水层石油醚液用氯仿或乙醚萃取

水层氯仿或乙醚液乙酸乙酯萃取

水层乙酸乙酯液正丁醇萃取

水层正丁醇液中药粉末用乙醇提取，滤液，回收乙醇，用水混悬，用石油醚萃取[乙醇浓度的影响95%乙醇可提取生物碱、挥发油、树脂和叶绿素；60—70%的乙醇可提取苷类成分；40—50%的乙醇可提取强心苷和鞣质；20—30%的乙醇可提取蒽醌及其苷类成分；][水对植物细胞的穿透力最强，因此用有机溶剂进行提取时一般可以先以水浸润干燥后再提取。]渗漉与加压固液提取渗漉是不加热的连续抽提，缺点是溶剂用量大，回收费时，优点是不受热，溶剂可以套用。一般到无色或渗漉液体积相当于药材量的10倍时可停止渗漉。加压固液提取是将干燥的中药粉末装入柱中，用泵加压使提取溶剂通过柱床，Dionex公司ASE200型提取器，每次提取20min即可，提取温度也可调整到200℃其规格有11、22、33ml的。一般提取分离情况有2种，即已知化学结构类型的成分和一无所知的成分。对于已知结构类型的成分可借助文献等设计分离方法。而对于无任何信息的中药，关键是先有疗效，然后跟踪分离。先做化学成分预试，然后设计提取分离方法。1．各种试剂对化学成分的溶解度都不是绝对的，有相互夹带，需注意；2．有机溶剂的渗透性差，所以用有机溶剂提取前可先将中药用水润透，干燥后再用有机溶剂提取，效果会更好；3．中药水提液如处理不及时，因其中含糖、蛋白质等营养物质易发霉，为防止发霉，可加入少量甲苯、甲醛或氯仿等做防腐剂；4．用水渗漉时，有时室温较高，在渗漉过程中，中药会发酵，为防止发酵可用氯仿饱和的水进行渗漉；提取过程中的几点经验及注意2.3溶剂分配溶剂分配主要是根据待分离物质在不相混溶的两相中分配系数的不同得以分离。是一种简便快捷的方法。在得到提取物之后，接着用溶剂分配可除去大量外来杂质，特别是在进行生物活性跟踪分离时可快速得到富含所需成分的部分。如用于从植物中寻找抗肿瘤成分，抗HIV的活性成分，生物碱成分，对紫杉醇的初步纯化等。在从植物中寻找新的具有抑制HIV活性的化合物时，一以1：1的二氯甲烷与甲醇及甲醇相继提取植物材料时，对各部位进行溶剂分配。具体方法如下：将粗提物首先在己烷与10%水-甲醇之间进行分配，极性大的下层调至含水25%，用四氯化碳进行分配，上层加水至含水35%，用氯仿继续提取；当从水相中蒸除甲醇后，用乙酸乙酯对剩余水相进行萃取。在用上述方法对马来西亚藤黄科植物Calophyllumlanigerum进行研究时，植物中具有抗HIV活性的物质集中于己烷与四氯化碳提取部位。对这两个部位进行进一步分离，得到一系列calanolides香豆素类物质。Gustafson等（1992）用类似的溶剂分配法从大戟科萨摩亚植物Homalanthusnutans中分得一个极性相对较大的12-去氧巴豆醇（12-deoxyphorbol）酯类化合物Prostratin，并发现它可以抑制HIV-1的细胞杀伤作用。Prostratin2.4滤过滤过是在分离之前的最基本的操作，以除去颗粒杂质。可以用绢布、滤纸、垂溶玻璃漏斗等。此外，也可使溶液通过装有硅胶或其他填料的短柱进行纯化，这样可以除去其中有强吸附力的污染物，这些污染物在进行柱色谱分离时可能会产生不良的后果。滤过困难的时候可采用离心的方法，现今还有用絮凝剂或澄清剂的。2.5凝胶过滤在色谱分离前使用象SephadexLH-20一类的分子排阻凝胶色谱也是常用的样品净化手段，有利于样品的进一步分离提纯。（详见该章）2.6沉淀可自然沉淀和试剂沉淀，自然沉淀是除去溶液中的颗粒杂质或热溶，冷不溶的杂质，也可用生物碱沉淀试剂，也可有醇提水沉或水提醇沉，以除去杂质。作为一种初步纯化方法，沉淀还经常被用于皂苷的研究中。将含有皂苷的提取物，（如经过丁醇—水分配之后）的浓缩甲醇液倾入大量的乙醚中，利用滤过或离心的方法收集沉淀的皂苷。反复利用这种沉淀法可达到更好的效果。2.7色谱分离的固态上样法拟进行柱色谱分离（各种柱色谱，干柱、减压柱、加压柱等）的样品在洗脱剂中溶解度不佳时，可采用固态上样法。首先将样品溶在适当的溶剂，然后加入5倍量的失活吸附剂，（或硅藻土），将该混合物在30—40℃下用旋转蒸发仪蒸干，然后把所得的粉末撒到色谱柱的上部，样品上要盖上一层净砂或粗硅胶，或玻璃珠，以保护样品的平面，保证层析效果。2.8脱除叶绿素一般脱除叶绿素的方法可以是醇提水沉或直接用水提取，而一种新的方法，如果不存在溶解度的问题，将提取物通过装有十八烷基硅胶的短柱可把所含的叶绿素方便地除去。例如从蔷薇科植物Dryasoctopetala

中分离黄酮苷之前先将该植物的乙醇提取物，通过硅胶短柱以除去其中的单宁，然后再经过一个C18硅胶柱可以清除其中含有的叶绿素。同样在利用中压或高压液相色谱从菊科植物Bidenscampylotheca（鬼针草属）中分离具有抗炎活性的聚炔类化合物时，先将植物地上部位的己烷提取物悬浮于甲醇中，使之通过Sep-PakC18硅胶柱，以甲醇洗脱，即可将其中的叶绿素脱除。2.9去除蜡质去除蜡质的简便方法是热水提放冷析蜡，而先用石油醚提取也可先除去叶绿素。或直接用乙醇提取，提取物则不含叶绿素，回收乙醇，再用石油醚提取，以除去油脂和蜡。而用乙腈除去所含的蜡质是较合适的方法。如将茄科植物Petuniaintegrifolia

的氯仿提取物（显示昆虫拒食活性）悬浮于沸腾的乙腈中搅拌1h，冷却至5℃后，析出蜡状的固态物质。在倾出的上清液中约含有原来提取物的50%。再将该溶液流经C18柱，以乙腈洗脱，可除去其中的叶绿素及一些低极性脂类物质。对具有活性的petuniolides（麦角甾烷类衍生物，如petuniolideC）进行半制备HPLC分离而使其得到纯化。在对菊科植物黄花蒿Artemisiaannua中具有细胞毒的黄酮类和萜类物质进行分离的过程中，也采用了乙腈沉淀的方法。先将该植物的地上部分用己烷提取，提取物溶于20ml氯仿中，加入180ml乙腈后析出蜡质，然后，再进行色谱分离工作。petuniolideC2.10脱除单宁类物质对植物某一部位进行生物活性测试前，有时要求先除去单宁类物质。可用以下几种方法，用明胶/氯化钠溶液沉淀；用可溶解的聚乙酰吡咯烷酮（PVP）、咖啡因或皮粉处理；或经过聚酰胺柱处理。在上述几种方法中最后一种是最有效的方法，但其选择性较差，有时也回吸附一些除单宁以外的多酚类化合物，因此也有一定的不足。Tan等曾将该法用于对人体免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶（HIV-1RT）有抑制作用的的植物提取物的筛选，同时对去除单宁的几种法也进行了比较。在上述方法中，去除单宁的机理是单宁的酚羟基与沉淀试剂中的酰胺官能团形成氢键，产生了不溶的复合物沉淀。存在的问题是一些进有酚羟基的非单宁类物质（如某些黄酮类化合物）也可能被除去。此外，醌类化合物与所用的试剂之间由于会产生共价作用，也可能被除去。如果想要除去所有的酚类化合物，采用乙酸铅沉淀法是最有效的途径。用10g 乙酸铅溶于100ml水的溶液可达到此目的。聚酰胺法，该单宁去除法是是由Wall等于1969年建立的。当需要进行生物活性测试的植物提取物量少时，可取3mg该提取物，溶于最少量的水中，然后加到装有400mg聚酰胺粉的玻璃柱（10cm×0.6cm）上，依次用2ml水、2ml50%甲醇及5ml无水甲醇洗脱，收集所有的流分。甲醇可将含有两个或3个酚羟基的非单宁类化合物洗脱下来，即可回收大部分黄酮类化合物。固相提取柱的另一制备方法是将1gMachereyNagel聚酰胺SC6（预先用水溶胀）加入一个装有玻璃棉塞的12ml注射器做柱用，将3-6mg的提取物溶于少量水中（＜0.5ml）之后，加到柱上，先用2ml水洗脱，然后以甲醇-水（1：1）2ml洗脱，再以甲醇5ml洗脱。聚乙烯吡咯烷酮法（PVP）Loomis和Battaile1966年就对该法做过介绍。用500ml10%（w/v）的PVP溶液足以从2mg植物提取物（溶于0.5ml水）中完全除去单宁。这相当于以50mg/ml（5%w/v）这一有效浓度的PVP溶液处理2mg/ml的植物提取物。皮粉法欧洲药典规定将0.75g粉碎的植物加入150ml水中，煮沸30min，将溶液滤过，取100ml滤液加入1g皮粉，振摇60min，以除去水相中的单宁。我们通过实验发现，取100mg植物或其他提取物置于10ml25%乙醇或水中，加入200mg皮粉搅拌60min。然后可将混合物滤过，蒸发滤液，可可除去其中的单宁。此外还有醇溶液中调pH法等（氨水）。2.11固相提取法固相提取预制柱的工作原理与液-固提取相同，常用下面两种方式：1）样品中的干扰性杂质被吸附于于柱上，而所需的化合物被洗脱下来；2）需要的化合物被吸附于柱上，而干扰性杂质被洗脱下来。后者可起到浓缩化合物的作用，通过更换溶剂将所需的化合物洗脱下来。有很多公司生产装有正相及反相吸附剂的固相分离柱。固相提取法很适合于自动化操作，尤其适用于对大量样品进行常规纯化。有报道将头盔目软体动物Philinopsisspeciosa的提取物首先通过C18BondElut短柱进行初步纯化，然后利用半制备型高压液相色谱法分离得到2位十六烷酮基取代的吡啶类化合物。将番茄酱的石油醚提取物通过一装有硅胶的短柱（BondElut），用石油醚洗脱，除番茄红素（红色）外的胡萝卜素类化合物都被洗脱下来。番茄红素则可用氯仿洗脱，再进一步用半制备型高压液相色谱分离，得到纯品。估计上述硅胶短柱最多可吸附溶于105ml石油醚中的31mg番茄红素。番茄红素（红色）2.12制备型高压液相色谱的样品预处理在高压液相色谱进样之前，需对样品进行过滤，使用能套在注射器上的滤片可以除去样品中混有的颗粒状杂质，既方便，又价廉。颗粒状杂质可能损坏高压液相色谱仪的阀门，阻塞管道或柱子入口端的滤板。滤片可以是不锈钢或塑料套的，但通常用一次性的聚丙烯外壳的滤片。这种滤片一般有凹陷的入口一细凸的出口可与注射器相连。过滤膜的材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纤维、尼龙、纸或无机膜。在选用过滤膜时应注意使其适合于所用的溶剂，在一点在使用含四氢呋喃的溶剂时尤其重要。过滤膜的孔径可在0.1-2μm之间—0.45μm孔径的过滤膜可适用于绝大多数场合。可用MillexHV滤片或类似的孔径经过严格检测的过滤膜。在使用硅胶为固定相进行中压液相色谱分离时，样品的预处理不是很重要，因在分离结束后固定相及残留在其上的杂质通常被丢弃。然而在使用制备型高压液相色谱进行分离或固定相为反相硅胶时，由于色谱柱很贵，需对样品进行预处理，以除去减缓流速的杂质。样品的预处理工作可采取不联机或联机两种方式进行。前者可使用常压色谱柱分离以及通过粗硅胶或短柱过滤等方法。在色谱柱与进样器之间安装前置柱可除去颗粒状杂质和/或吸附性强的样品组分。前置柱通常装有少量与色谱柱相同的填料，如填充得当，对系统的分离效果不会造成很大影响。硅胶预处理柱可防止含有缓冲盐或碱的流动相所引起的麻烦，上述物质可破坏键和相填充料的硅胶骨架，常会在柱的上部形成空隙。预处理柱安装在泵与进样器之间，这样尽管流动相被硅胶所饱和，但在进样途中不会有空隙或气泡。联机纯化方法也可采用柱转换的方式来完成，Okano等(1984)在分离25一羟基维生素r]2时即利用了这种方法。如图2．2所示，与进样器相连的前置柱被用来吸附25一羟基维生素砬，而低极性的组分被洗脱下来。然后将六通阀转到图示的虚线位置，增加溶剂的极性，待纯化的样品被洗脱进入循环高压液相色谱系统。该方法与Sep-Pak短柱具有相同的纯化功能。当将较大体积的样品溶液直接加到HPLC柱上时，该方法还可起浓缩的作用，因而十分有用。2.2超临界流体提取（SFE）该方法尤其适用于对热及化学不稳定的化合物的提取，并主要用于从混合物中提取低极性成分。如原本用水蒸气蒸馏或索氏提取的可用SFE法有效替代。这种方法提取速度快，并可通过调节压力，提高溶剂的溶出能力。选择适当的温度与压力能提高提取的选择性能，并获得更干净的提取物，收得率也高于常规的液-液及液-固提取。超临界流体提取不必使用大量的有机溶剂，因而具有显著的安全性。另外，它对环境的污染也很小，特别是它减少了含卤素溶剂的使用。许多超临界流体具有质量传递性能（与液-液及液-固提取相比，具有低黏度和高扩散率，适合于对植物组织的提取），在室温时呈气态，相对惰性、无毒且价格低廉，如二氧化碳、氧化氮和氨气等。也可通过加入甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷及水等溶剂以改善其提取性能。利用SFE法而获得的天然产物种类正迅速增多，不仅有植物样品，还有微生物样品。其中，一些较成熟的应用实例包括蛇麻草提取物的制备，从烟草中提取尼古丁，从咖啡中提取咖啡因等。以SFE方法进行香料、调味品及精油的提取更具有重要的经济价值。利用超临界流体二氧化碳从植物星状回芹（staranise）中提取茴香脑（纯度＞90%）比用传统的溶剂提取法更有效，后者不仅工艺烦琐、费时，而且成本更高。在从石蒜科植物中提取生物碱的过程中，有人研究了几个可提高收率的因素。在渗漉之后，采用超临界氧化氮提取方法，获得了很好的效果用超临界流体二氧化碳从腰果壳中提取酚性漆树酸（anacardicacid），5-十五碳二烯间苯二酚（cardal）和腰果酚（cardanol）衍生物时，所得产物比用戊烷提取所得的产物质量更好。用超临界流体二氧化碳从木兰科植物荷花玉兰（Magnolia