P6BMP2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

P6BMP2的克隆及其在大肠杆菌中的表达【摘要】 目的：在大肠杆菌中克隆和表达骨形态发生蛋白 2BMP2）的变体P6BMP2并初步纯化。方式：依照P6肽的氨基酸序列，依照大肠杆菌偏爱密码子将P6肽的核酸序列设计在5′端引物，通过PCR方式合成P6BMP2基因，并将其克隆到大肠杆菌表达质粒pALEX中，经NcoⅠ、XhoⅠ双酶切和DNA序列测定验证。结果：通过双酶切和DNA序列分析，证明取得的基因片段与咱们期望的相符合，重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导取得表达。表达产物经超声破碎和HeparinSepharoseTM6FastFlow亲和层析纯化，取得重组蛋白。结论：构建了P6BMP2的表达质粒，取得P6BMP2的表达并成立了纯化方式，为P6BMP2的深切研究和应用奠定了坚实的基础。【关键词】 骨形态发生蛋白;P6;P6BMP2;大肠杆菌;胶原蛋白;表达自1965年Urist[1]发觉骨基质中含有能够诱导异位成骨的骨形态发生蛋白(bonemorphogeneficprotein，BMP)以来，研究者们通过大量动物实验和临床应用研究证明，BMP能在非骨组织如肌肉中诱导形成软骨和骨，是一种高效的骨诱导蛋白，其中BMP2被以为是活性最强的唯一能单独诱导骨形成的因子[2]。由于愈来愈多的实验证明了BMP2在诱导骨形成和骨修复方面的高效性及平安性， 人们开始将其应用于骨科临床，并取得了令人中意的疗效 [3 6]。另一方面,在骨缺损的修复重建进程中，成骨细胞产生的Ⅰ型胶原具有特定的引导骨组织修复再生的生物学特性，在增进成骨细胞的粘附、增殖和分化同时，对破骨细胞的吸收也有必然作用。这些功能据推测与其分子结构中含有特定的细胞识别信号有关 [7]，Bhatnagar等[8 9]发此刻Ⅰ型胶原α链中含有有效细胞结合位点，为一段15个氨基酸序列的细胞结合肽，其与ABM(无机骨粒)相结合可模拟骨细胞外基质成份，增进骨再生。Bhatnagar[10]以此为基础,发明了一组用来模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的肽段,IleAla是其核心序列，呈现β弯曲构象。P6肽是其中的一种,其序列是GlnGlyIleAlaGlyGln。周炳荣等[11]的研究显示，P6肽能够刺激人骨髓间充质干细胞的增殖；杨旭东等[12]那么将P6肽和无机骨粒复合用来医治骨缺损，结果显示该复合物具有较强的增进骨缺损修复能力。这些都说明P6肽具有必然的增进间充质干细胞增殖，加速骨组织修复和再生的能力。为了将BMP2和胶原蛋白在引导骨组织修复或再生中的功能结合起来,咱们构建了P6BMP2融合蛋白，希望那个融合蛋白能够提高骨形成能力。材料与方式材料菌株克隆菌株Top10和表达菌株BL21(DE3)均由本实验室保留。基因和质粒pALEX和pCI BMP2由本实验室保留。酶及化学试剂各类限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq聚合酶等购自Takara公司；RNasin购自Promega公司；引物片断由上海博彩生物公司合成；柱离心胶回收试剂盒购自华舜公司；HeparinSepharoseTM6FastFlow购自Phamarcia公司；其他化学试剂均为国产分析纯。方式质粒DNA提取、DNA酶切及连接转化 参见参考文献[13]方式。pALEX/P6BMP2质粒构建P6BMP2序列PCR产物经TBE agarose回收特异片段，溶解于TE溶液中，取适量进行NcoⅠ、XhoⅠ双酶切。质粒pALEX进行NcoⅠ、XhoⅠ双酶切，别离对酶切的378bp左右的P6BMP2片段和pALEX质粒片段进行柱离心式胶回收， T4DNA连接酶连接，转化 Top10 菌株，酶切及 PCR法挑选阳性克隆，取得质粒pALEX/P6BMP2。测序验证序列正确，测序引物为 T7terminator 公用引物，引物序列如下（划线处为限制性酶切位点， 方框处为P6肽编码区）：P6BMP2PCR上游引物（P6BMP2forward）为 5′CGTTCCCATGGGACAGGGTATCGCTGGTCAGCAAGCCAAACACAAACA3′；GCGGP6BMP2PCR 下 游 引 物 （ BMP2down） 为 5 ′CAAGCCTCGAGTTAGCGACACCCACAACCCTC3′。质粒DNA序列的测定 由上海博彩生物公司完成。pALEX/P6BMP2质粒表达和产物的查验质粒转化BL21（DE3）表达宿主菌后，挑取单克隆于37℃振荡培育留宿，将留宿菌以1∶100的体积接种于新的LB培育液中，37℃培育2h至OD600nm约为，加入IPTG至终浓度·L-1，30℃诱导表达3h，搜集菌体,用15%的SDSPAGE进行分析。蛋白质大量表达及纯化 挑取单克隆表达菌株培育留宿，第 2天取10ml接种于1LLB培育基中，培育并诱导表达3h后搜集菌体，用缓冲液A（50mmol·L-1Tris，150mmol·L-1NaCl，）重悬菌体，超声破碎后将上清上样于HeparinSepharoseTM6FastFlow亲和柱，用缓冲液A洗至基线后进行梯度洗脱（20mmol·L-1Tris,,4mol·L-1尿素到20mmol·L-1Tris,,4mol·L-1集洗脱峰，最后将洗脱峰脱盐脱尿素取得

尿素，1mol·L-1NaClP6BMP2样品。 2

），搜结果PCR取得P6BMP2基因依照已知的人BMP2基因序列，咱们设计的5′端引物增加了NcoⅠ位点，并在BMP2编码区的N端增加了一个P6肽的编码区，于3′端引物终止密码子前增加了XhoⅠ位点。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，所得条带与378bp的理论值一致。见图1。产物；2.分子质量标准DL2000，从上到下依次是2000、1000、750、500和250bppALEX/P6BMP2质粒的构建利用 T4DNA连接酶连接别离经 NcoⅠ和XhoⅠ消化的 P6BMP2基因片断与 pALEX载体，连接产物转入Top10克隆菌株，经双酶切鉴定取得含 pALEX/P6BMP2的阳性克隆(图，对重组质粒pALEX/P6BMP2进行核苷酸序列分析说明，在重组质粒的T7启动子下游插入DNA片断与预期的完全一致。图3为重组表达质粒pALEX/P6BMP2,P6BMP2编码的氨基酸序列如下（方框内为P6肽的氨基酸序列）：MGQGIAGQQAKHKQRKRLKSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCG。1.CR分子质量标准DL2000，从上到下依次P6BMP2的表达及纯化含有表达质粒 pALEX/P6BMP2的BL21(DE3)表达菌株经诱导，搜集菌体进行 15%的SDS讨论骨形成蛋白是转化生长因子β超家族的成员，属于二硫键交联的生长和分化因子。它是一类具有多种功能的细胞因子家族，一方面，BMP是一种能诱导未分化间充质细胞向骨和软骨发生不可逆转化的蛋白质；另一方面，BMP不仅能够增进骨和软骨组织的形成，而且在中胚层诱导、肢体发育、牙齿发育、造血细胞形成、内脏的分化和其它生长因子基因的调剂等方面也扮演着重要角色。它关于细胞的增殖、凋亡、分化和形态遗传都起着重要作用。Ⅰ型胶原分子共由3条链组成,包括2条α1链和1条β2链,每条链大约由1000个氨基酸残基组成。Yukna等[14]将含有Ⅰ型胶原细胞结合位点的 15个氨基酸序列合成肽(P15)与羟磷灰石复合后,增强了人成纤维细胞粘附及增殖能力,增进了牙周病患者牙槽骨缺损的修复。而P6肽为模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的一个小肽，它来源于P15肽，是P15肽的一部份，包括了P15肽功能所必需的核心部份IleAla。P6肽具有P15肽的生物功能，其对骨髓间充质细胞的增殖具有增进作用[11]。为了将P6肽和BMP2在增进骨组织修复进程中的优势结合起来，咱们构建了融合蛋白P6BMP2，并在大肠杆菌中实现了表达。依照文献[15]报导，BMP2含有一个肝素连接位点，因此，将表达上清直接上HeparinSepharoseTM6FastFlow柱进行亲和层析，由于BMP2蛋白在中性盐溶液中的低溶解性，咱们在纯化进程中保留了 4mol·L-1尿素，以增加重组蛋白的溶解度 [16]，避免重组蛋白沉淀在柱子上。实验结果显示，P6BMP2能够专门好地连接到 HeparinSepharoseTM6FastFlow柱，说明P6BMP2中的肝素结合区域的构象未发生改变，从另一个侧面证明了 P6BMP2的氨基酸序列及其构象的一致性。咱们构建了融合蛋白P6BMP2，并取得了纯品，为进一步深切研究其生物功能、尤其是在动物体内诱导成骨的生物活性奠定了坚实基础。【参考文献】[1]URIST M : formation byautoinduction[J].Science,1965,150:893 899.[2]RILEYEH,LANEJM,URISTMR,etmorphogeneticprotein2:biologyandapplications[J].ClinOrthopRelatRes,1996 ，324:39 46.[3]JOHNSONEE,URISTMR,FINERMANGofsegmentaldefectsofthetibiawithcancellousbonegraftsaugmentedwithhumanbonemorphogeneticprotein: apreliminary report[J].Clin OrthopRelatRes,1988,236:249 257.[4]JOHNSONEE,URISTMmetaphysealtibialnonunionsassociatedwithsignificantbowingdeformityandcorticalboneloss:treatmentwithhumanbonemorphogeneticprotein(hBMP)andinternalfixation[J].NipponSeikeigekaGakkaiZasshi,1989,63(5):613620.[5]JOHNSONEE,URISTMR,FINERMANGnonunions andpartialorcompletesegmentaldefectsoflongwithimplantscompositeofhumanbonemorphogeneticprotein(BMP)autolyzed,antigenextracted,allogeneic(AAA)bone[J].ClinOrthopRelatRes,1992,277:229237.

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