生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术1课件

第十四章电泳分离技术前言1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：

1、提高分辨率及灵敏度。

2、简化操作，缩短电泳时间。

3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。1.电泳技术的基本原理(2)影响泳动率u的因素

内因：1.净电荷

2.质点大小

3.质点形状

外因：1.V(U/L)

2.缓冲液的pH(pH恒定)

3.离子强度[I]

最适:0.02-0.2

4.电渗：液体对固体支持物的相对移动(3)电泳类型

a.载体电泳

纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。

凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳

b.自由界面电泳

支持物为溶液，很少用。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂

N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。■

丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反应交联剂造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBisBis聚合反应交錯连結自由基形成光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。

过硫酸铵(NH4)2S2O3

APS

(引发剂)

N,N,N,N’-四甲基乙二胺，TEMED(加速剂)2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效应

⑴样品浓缩效应

⑵分子筛效应⑶电荷效应三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高①凝胶孔径不连续性

单体浓度

交联度

大孔胶:T=3%C=2.0%

小孔胶:T=7%C=2.5%凝胶网孔大小:

聚合链长度:由Acr浓度交联程度:由Acr与Bis相对比例

Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比

如:AcrBisT(%)

小孔28.0g0.735g7%

大孔10.0g2.5g2.5%凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。

分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质<104

20-30 1-4×104

15-201-5×104-1×105 10-15 1×105

5-10 >5×105

2-5 核酸(RNA) <104 15–20 104–105

5-10 105-2×106 2-2.6③pH的不连续性

pH

大孔(浓缩)胶6.7

小孔(分离)胶8.9

缓冲液8.3

A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子、慢离子

B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。

C显示蛋白质样品分离成数个区带。

电泳过程示意图不连续系统浓缩效应示意图连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板

(前,后)样本梳间隔条间隔条浓缩胶分离胶不连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条■

电泳凝胶系统的组成：1电泳系統pH胶体浓度缓冲液上层(负极)缓冲液2样品溶液3浓缩胶

6.9

4分离胶

胶体

5下层(正极)缓冲液Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-glycine

Tris-glycine

8.3

8.3

8.3

8.3

5%

7.5~20%

-

-

-

●

不连续胶有聚焦样品的作用变性胶与非变性胶：变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进行。非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。■

SDS在蛋白质表面均匀敷上

一层负电：SDSboiling变性蛋白质成一线状分子原态蛋白质並且均匀带上一层负电荷非极性尾部极性头部图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

架膜加盖接导线，开机3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白电泳仪器实验操作：

浸泡

将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。

点样

用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。

电泳

将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。

染色

将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重染色10min。

漂洗

将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。4.等电聚焦(IsoelectrofocusingIEForEF)原理

Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。

EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的、稳定的、线性的pH)。原理（续）

当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。方法（EF的关键）

⑴载体两性电解质CA分辨率0.01pH

⑵固相pH梯度

以具弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物CH2＝CH─CO─NH─RR=─COOHR=─4级氨基

R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系体系分辨率达0.001pH

pH梯度范围最窄可为0.01pH/cm

CAIEF是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子；在电场中,CA迁移到自己的pI而形成pH梯度.5.电泳技术问题及对策1).低离子溶液中,不同电荷的蛋白质分子间会发生相互静电作用,增加溶液离子强度可减少这种作用,但会提高电泳时的电流,使产热更多,温度升高又促进蛋白质的扩散,使区带变宽,分辨率下降.因此电泳缓冲液的离子强度必须控制适当。0.02-0.2M的离子强度离子强度低,速度快,发热低,有电渗离子强度高,速度慢,发热大电泳技术问题及对策2).蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓冲液的pH值,应仔细调整和控制电泳缓冲液的pH值,使各组分分子的净电荷数差异加大.但极端pH下蛋白质会变性失活,因此一般控制在pH4.5～9.5之间;电泳技术问题及对策3).缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用,因此必须根据分离溶质的不同选择合适的缓冲系统;电泳技术问题及对策4).表面活性剂(SDS等)强烈破坏蛋白质分子间的非共价作用,使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围,阻止了蛋白质之间的相互作用,同时也消除了不同蛋白质固有的电荷差异;电泳技术问题及对策5).控制电泳介质的有效