医学免疫学实验五 流式细胞术(Flow Cytometry)的原理及应用

实验五

流式细胞术(FlowCytometry)的

原理及应用DEPARTMENTOFIMMUNOLOGY

1细胞染色（流式细胞术）

2流式细胞术调整仪器设置收集数据分析结果3课堂目标了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌握“门”，“补偿”两个基本概念。学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的单个核细胞中CD3+、CD4+、CD8+细胞的比例。4Content流式细胞仪的简介流式细胞仪的组成及原理流式细胞术的应用流式细胞术实验操作流程及数据分析5什么是流式细胞术？流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种快速、准确、客观的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。FACS-FluorescenceActivatedCellSorting6样本类型7可检测颗粒大小0.2μm50μm8流式细胞仪能检测哪些信息?相对大小:

ForwardScatter(FSC)相对颗粒度或内部复杂程度:

SideScatter(SSC)通过荧光强度可以分析：细胞表面标志物细胞内部因子细胞分泌因子DNA含量等……FSCDetector

SSC&FluorescenceDetectorsIncidentLightSource9PartII流式细胞仪组成及原理10流式细胞仪组成Fluidics(液流系统)流体动力学聚焦样本形成单细胞流Optics(光学系统)激发和收集光信号Electronics(电子系统)扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑11液流系统（Fluidics）液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处鞘液桶废液桶样品管检测过滤网488nmlaser光源12液流系统:流动室(FlowCell)13光学系统（Optics）激发系统Excitationoptics:激光器laser透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区收集系统Collectionoptics:光学镜片和滤光片光信号检测器14OpticsSubsystemDetectorarraysFlowcellLaserLaserSamplecoreCollectionlensLensExcitationopticsFiberopticsLaserFSCdiode405nm640nm488nm15电子系统（Electronics）光信号被转换成电信号，并进行合适放大.电信号脉冲被分析和计算，补偿运算.模拟信号被转换成数字信号.数据转移并被存储于电脑中.16直方图(DistributionHistogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。17散点图(DotPlot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。18流式原理总结流式能够提供的信息包括：颗粒的相对大小，内部复杂程度，和标记上去的荧光强度.颗粒由液流包裹到达检测区，产生信号.检测系统将光信号转换成电信号.每个颗粒的信息存储成数据格式，记录下来.19前向角散射光（FSC）当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征细胞相对大小及其表面积。20侧向角散射光（SSC）与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表征细胞粒度及细胞内相对复杂性。21散射光信号，散点图(DotPlot)22PartIII流式细胞术的应用23流式细胞术应用

细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量……细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位……24流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病25PartIV流式细胞术实验操作流程及数据分析26流式细胞术操作流程样本收集及处理免疫荧光染色上机检测数据分析制备单细胞悬液荧光补偿27荧光染料★必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发★激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内★荧光素光谱的重叠应当尽量减少三原则:28光谱重叠（Spectraloverlap）

FITC和PE荧光光谱

530/30585/4229光谱重叠（Spectraloverlap）补偿模型图

30补偿调节前后对比FL1FL231同型对照（Isotypecontrol）例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE

对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：

FITC:细胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:细胞加上AbBPE,IgG1FITC同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2.同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异性结合水平。32数据收集和分析1画图（直方图，散点图）2寻找目标细胞3调整仪器设置到合适的状态4我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？33数据分析设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数34设门Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要