工业用微生物菌种自然更改

工业用微生物菌种自然更改第1页/共57页本章内容第一节菌种的来源第二节发酵高产菌种选育第三节菌种退化和菌种保藏第四节微生物菌种的扩大培养第2页/共57页第一节菌种的来源一、工业发酵常见微生物二、工业微生物的来源三、微生物菌种的选择性分离四、重要工业微生物菌种的分离第3页/共57页一、工业发酵常见微生物细菌酵母菌霉菌放线菌第4页/共57页最常用的工业微生物细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌/jpkc第5页/共57页最常用的工业微生物酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属/jpkc第6页/共57页最常用的工业微生物霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉/jpkc第7页/共57页最常用的工业微生物放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌/jpkc第8页/共57页

工业微生物来源向菌种保藏机构索取有段的菌株，从中筛选所需菌株。从自然界采集样品，从中分离筛选。从一些发酵制品中分离目的菌株。/jpkc第9页/共57页1）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京；中科院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京；卫生部药品生物制品检定所，北京；中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京

我的微生物菌种保藏机构第10页/共57页1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）国外主要的微生物菌种保藏机构第11页/共57页第12页/共57页菌种选择的总趋势野生菌→变异菌自然选育→代谢控制育种诱发基因突变→基因重组的定向育种

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2.菌种选择的要求

能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；

生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；/jpkc第14页/共57页2.菌种选择的要求（续）菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。/jpkc第15页/共57页采样富集分离筛选贮藏16二、微生物菌种的选择性分离熟记第16页/共57页1.筛选的两种指导思想

先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株

/jpkc第17页/共57页2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；

生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性指导性/jpkc第18页/共57页设计筛选方案时必须考虑两个要点

选择性灵敏度

/jpkc第19页/共57页3.新种分离与筛选的步骤

调查研究（包括资料查阅）

试验方案设计

含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微生物的可能性大？）

样品预处理（如何在后续的操作中使这种可能性实现）

菌种分离

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根据目的菌株及其产物特点分

选择性分离方法 随机分离方法

(定向筛选←选择压力)

(用筛选方案-检测系统进行间接分离）

富集液体培养固体培养基条件培养

(初筛)

菌种纯化

复筛

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菌种纯化初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等

/jpkc第22页/共57页含微生物样品的采集采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种/jpkc第23页/共57页采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。第24页/共57页从自然界筛选第25页/共57页2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。第26页/共57页样品的预处理目的：提高分离效率方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法诱饵法/jpkc第27页/共57页分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特

生长特征独特

无选择性特征根据产物的特征进行

随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。选择性分离

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选择性分离原理和技术生长条件的选择与控制原理控制营养成分

控制培养基酸碱度

添加抑制剂

控制培养温度

控制通气条件

选择性分离技术富集液体培养技术固体培养技术施加选择压力，进行定向筛选

/jpkc第29页/共57页A.富集液体培养增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（μ）筛选/jpkc第30页/共57页

μ

ABS0基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响

当S<S0时，富集什么菌株？当S>S0时，富集什么菌株？/jpkc第31页/共57页连续富集培养技术分离菌株的优点

分离的菌株特别适合连续发酵生产过程有利于分离具有某种工业生产特性的菌株可以筛选出能共生的稳定混合培养物

/jpkc第32页/共57页B.固体培养技术常用于分离某些酶产生菌

选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质

/jpkc第33页/共57页随机分离原理与技术从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。随机分离技术举例

抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌的筛选

/jpkc第34页/共57页高产培养基设计的几个原则

制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。/jpkc第35页/共57页抗生素产生菌的筛选筛选模型：试验菌筛选方法：铺菌法复印平板法液体培养筛选

抗药性筛选筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同

I II无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性

固体培养筛选/jpkc第36页/共57页试验菌代表微生物类型金黄色葡萄球菌209p革兰氏阳性球菌枯草杆菌6633 革兰氏阳性杆菌 大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌耻垢分枝杆菌607

结核杆菌 白色念珠菌 酵母状真菌 青霉菌

丝状真菌

/jpkc第37页/共57页药理活性化合物产生菌的筛选

药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。筛选模型：目标酶/jpkc第38页/共57页生长因子产生菌的筛选

筛选模型：营养缺陷型试验菌

筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长/jpkc第39页/共57页氨基酸产生菌的筛选

样品

预处理

初筛（除真菌）

在分离平板上生长获得多个单菌落复印平板（copy法）

平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸对应到copy前相应

u.v线杀死长好的菌落

位置，找到目的菌落

再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂

培养后

产氨基酸菌落周围有生长圈

目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株第40页/共57页多糖产生菌的筛选取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。/jpkc第41页/共57页细菌分离：以乳酸菌为例

取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中

加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检杆状，阳性染色初步断定乳酸菌

用选择性培养基分批富集培养2-3代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基

根据透明圈挑选菌落

性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）

Rf值定性（有机酸呈黄斑点）

乳酸生成量测定（滴定法）/jpkc第42页/共57页放线菌的分离：

以产链霉素菌种的分离为例

（从退化菌种中筛选）

取工业发酵液（含孢子）样品1环放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀

采用稀释法制平板，获取单菌落

斜面保藏高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落放大培养，发酵液性能测试/jpkc筛选模型：形态依据第43页/共57页真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例

取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7

稀释分离法取0.1ml加入固体培养基铺平皿（×2）

在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h

形态筛选根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用

纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次

①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定性能测定③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定/jpkc第44页/共57页菌种选育改良的具体目标提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品/jpkc第45页/共57页

发酵工业菌种改良方法常规育种(诱变育种)细胞工程育种基于代谢调节的育种技术基因工程育种蛋白质工程育种代谢工程育种

/jpkc第46页/共57页赖氨酸生产菌种的选育改良思路出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌育种思路

1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育

2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型

3.抗结构类似物突变株的选育：AEC4.解除代谢互锁：Leu-、

抗Leu结构类似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：

Ala-、抗Asp结构类似物

选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株

6.改善细胞膜的透过机能

7.选育温度敏感突变株

8.应用细胞工程和基因工程育种

第47页/共57页第48页/共57页选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径：①通过TCA循环葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸

赖氨酸②通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应葡萄糖磷酸烯醇草酰乙酸天冬氨酸式丙酮酸丙酮酸赖氨酸/jpkc第49页/共57页

代谢工程的定义利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。又称作途径工程，是多基因的基因工程。/jpkc第50页/共57页

代谢工程发展基础

代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔性节点：解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。/jpkc第51页/共57页

代谢工程发展基础相依网络：代谢网络中各主节点集中于