NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影响

NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶 3活性的影响【摘要】 研究日本新近研制的第三代 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA ，HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响。方法:采用细胞培养技术，以肝癌细胞系HepG2为靶细胞，以不同浓度的药物处理细胞48h后，利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst33258染色，荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶 3比色法检测caspase-3活性。结果:NK-104（10μmol/L）对HepG2细胞有明显抑制作用，可诱导HepG2细胞凋亡，并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG2细胞凋亡，其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。【关键词】 肝癌3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA ，HMG-CoA）还原酶抑制剂，统称为抑制素，是重要的脂类合成抑制剂， 主要在人体肝脏中代谢，临床上广泛应用于治疗高脂血症［ 1］。最近研究发现，HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性，与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用［ 2］、体内与5氟尿嘧啶（fluorouracil ，5-Fu）共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂［4］。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB ，PI3K-Akt）基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道［5］，但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG2通过2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑单钠盐｛［2-2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium ，monosodiumsalt］，WST-8｝、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶 3比色法等检测方法，研究 NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶 3（caspase-3）活性的影响，为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。材料和方法主要材料与仪器 NK-104，日本兴和有限公司（日本名古屋）和日产化学工业公司（日本东京）产品;荧光染料Hoechst33258、甲羟戊酸（mevalonic acid，MEV）和碘化丙啶（propidiumiodide ，PI）染色液（PI100g/L，1%Triton100，9g/LNaCl），Sigma公司产品。流式细胞仪，20XXFCA，美国BD公司产品。实验方法细胞培养人肝癌细胞株HepG2（美国ATCC公司产品）在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5%CO2、37℃条件下培养。实验中，细胞种植于适当培养皿中，90%的细胞融合时，用磷酸盐缓冲液洗净后，加入适量含有 NK-104和MEV（1mmol/L）等药物的培养液，37℃培养箱中培养。WST-8方法利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG2细胞（1×104个细胞/孔）接种于含100μl培养液的96孔培养板中，NK-104（～100μmol/L）治疗48h后，分别加入WST-8试剂10μl（日本同仁化学研究所）培养2h后，选择450nm波长，测定各孔的吸光度OD值。Hoechst33258染色细胞经药物刺激48h后，甲醇-冰乙酸（3∶1）细胞固定液4℃固定5min，磷酸盐缓冲液稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。用滤纸沾去多余液体，封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。流式细胞仪检测凋亡峰 在室温下将刺激48h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，并在适当的染色缓冲液中吸取100μl的细胞（1×105）至试管中。加入200μlRNaseA，37℃水浴30min，再加800μlPI染色液混匀，4℃避光30min后，立即上机分析。半胱氨酸蛋白酶3比色法经药物治疗48h后收集细胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定（Medical&BiologicalLaboratoriesCo.，LTD，Japan）。统计学方法数据均以x±s表示，采用SPSS统计软件进行统计分析，采用t检验。结果NK-104对HepG2细胞增殖的抑制作用 为了确定NK-104在人肝癌细胞HepG2中的治疗浓度，采用WST-8方法对细胞的增殖作用进行测定。与对照组相比，NK-104在10和100μmol/L时，对HepG2细胞生长均有明显的抑制作用。100μmol/L时，近50%的细胞死亡（P<）。见图1。图1不同浓度NK-104对HepG2生长的抑制作用（略）Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104**P<，vscontrolgroup.NK-104诱导细胞凋亡的形态变化 对照组细胞界限清晰，胞浆丰富，细胞核呈弥散、均匀荧光分布，经 10～100μmol/LNK-104处理后，HepG2发生细胞凋亡，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化。 见图2。NK-104对HepG2细胞周期的影响 与对照组相比，NK-104治疗组可明显诱导HepG2的细胞凋亡，出现相当比例的 DNA含量小于二倍体的亚 G1凋亡峰24%），不同周期细胞的比例也发生变化，与MEV共同作用后可消除NK-104的这种诱导作用。见图3。NK-104对caspase-3活性的影响与对照组相比，NK-104可明显诱导caspase-3活性（P< ），同样加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。见图4。图2NK-104处理48h后HepG2细胞核的形态变化（Hoechst33258染色，×400）（略）Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK-104for48hours（Hoeschst33258staining ，×400）A:Control ，normalnuclearstructure;B:NK-10410 μmol/L;C:NK-104100μmol/L; ●:Cytoplasmicchange; ■:Nuclearfragmentation.图3NK-104治疗HepG2细胞后细胞周期分布变化（略）Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK-104（PercentageofSubG1cells ）**P<，vscontrolgroup.A:Control;B:NK-10410

μmol/L;C:NK-104+MEV.图4NK-104对caspase-3活性的影响（略）Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3**P<，vscontrolgroup.TheHepG2cellswereexposedtoNK-104（10μmol/L）alone，orNK-104（10μmol/L）plusMEV（1mmol/L）for48hours.Thecaspase-3activitywasmeasuredwithacolorimetricproteaseassay.讨论目前认为恶性肿瘤是一种多基因异常的疾病，其发生的分子基础是原癌基因的激活或抑癌基因的突变失活或缺失， 导致某些细胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成肿瘤。原发性肝癌约 55%发生在中国［6］。肝癌细胞的凋亡在肝癌的发生发展、转归 及治疗等方面均有重要的意义。 HMG-CoA还原酶抑制剂，是重要的脂类合成抑制剂，临床上广泛应用于治疗高脂血症。最近研究表明，HMG-CoA还原酶抑制剂具有抗感染、降低炎性细胞因子水平及抗癌等生物学多效性作用。Otsuki等［7］报道1～30μmol/L的西米伐他汀（simvastatin）具有预防癌症的作用。Sutter等［8］研究认为1～10μmol/L的弗鲁伐他汀（fluvastatin）通过诱导Huh7细胞凋亡而抑制肝癌细胞的增殖。Denoyelle等［9］认为25μg/L的赛里伐他汀（cerivas-tatin）对MDA-MB-231人乳腺癌细胞通过抑制细胞核因子κB活性起到重要的抗转移作用。HepG2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征，是研究和评价防治肝癌药物的较理想的细胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA还原酶抑制剂，具有副作用小、高效和强力的药代动力学特点［4］。我们的研究结果表明，NK-104对HepG2细胞增殖有明显抑制作用，其最大抑制率可达50%左右，使HepG2细胞呈现典型的凋亡形态学特征，核质浓集，有凋亡小体。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖。流式细胞术具有检测的细胞数量大、反映群体细胞的凋亡状态比较准确等优点［10］。NK-104作用于HepG2细胞后，通过流式细胞仪分析，与对照组相比，可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置，并与细胞主峰 G0/G1分界清楚，可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究结果表明，NK-104可明显诱导HepG2细胞凋亡。细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase），其中研究最多，功能相对较明确的为caspase-3。caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶之一，为凋亡的效应分子，被称为凋亡的“执行者”［11～13］。激活的caspase-3可裂解相应的胞核内底物DNA修复酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP），使PARP失去对DNA的修复功能，导致细胞转向凋亡［14］。本研究表明，10μmol/LNK-104能够增强caspase-3的活性，加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。这一研究结果表明，NK-104诱导HepG2细胞凋亡与激活caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。【参考文献】1Goldstein JL，BrownMS.Regulation ofthemevalonatepathway.Nature.1990;343:425-430.2BellostS，PaolettiR.CorsiniA.Safeofstatins:focusonclinicalpharmacokineticsanddruginteractions.Circulation.20XX;109Suppl）Ⅲ:50-57.3ChanKK，OzaAM，Siu LL.Thestatins asanticancer agents. ClinCancerRes.20XX;9:10-19.4KajinamiK，TakekoshiN，SaitoY.Pitavastatin:effica-cyandsafetyprofilesofanovelsyntheticHMG-CoAreductaseinhibitor.CardiovascDrugRev.20XX ，21（3）:199-215.5WangJ，TokoroT，MatsuiK，etal.PitavastatinatlowdoseactivatesendothelialnitricoxidesynthasethroughPI3K-AkTpathwayinendothelialcells.LifeSci.20XX;76 （19）:2257-2268.6ChenJG，SongXM.Anevaluation onincident casesofliver cancerinChina.ZhongguoZhongLiu. 20XX;14（1）:28-31.ChinesewithabstractinEnglish. 陈建国， 宋新明. 中国肝癌发病水平的估算及分析 . 中国肿瘤.20XX;14（1）:28-31.7OtsukiT，SakaguchiH，HatayamaT，et al. Effects ofanHMG-CoAreductaseinhibitor ，simvastatin ，onhumanmyelomacells.OncolRep.20XX;11:1053-1058.8SutterAP ，MasserK，HopfinerM ，etal.Cellcyclearrestandapoptosisinductioninhepatocellularcarcino-macellsbyHMG-CoAreductaseinhibitors.Synergisticantiproliferativeactionwithligandsoftheperipheralbenzodiazepinereceptor.JHepatol.20XX;43 （5）:808-816.9DenoyelleC，VasseM，Korner M，et al. Cerivastatin ，aninhibitorofHMG-CoAreductase，inhibitsthesigna-lingpathwaysinvolvedintheinvasivenessandmetastaticpropertiesofhighlyinvasivebreastcancercelllines:aninvitrostudy.Carcinogenesis.20XX;22 （8）:11-1148.10Nilsson C，KagedalK，JohanssonU，etal. Analysis ofcytosolicandlysosomal pHinapoptotic cells byflow cytometry. MethodsCell Sci.20XX;25:185-194.11ChenYC，ShenSC，LeeWR，etal.EmodininducesapoptosisinhumanpromyeloleukemicHL-60cellsacpaniedbyactivationofcaspase3cascadebutinde-pendentofreactiveoxygenspeciesproduction.BiochemPharmacol.20XX;64（12）:1713-1724.12ZhouXL，ZhengSS