演示文稿第五章目的基因的获取

演示文稿第五章目的基因的获取现在是1页\一共有103页\编辑于星期六第五章目的基因的获取ppt课件现在是2页\一共有103页\编辑于星期六第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。现在是3页\一共有103页\编辑于星期六第一节

基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段。酶切现在是4页\一共有103页\编辑于星期六由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene现在是5页\一共有103页\编辑于星期六二、随机片段化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则现在是6页\一共有103页\编辑于星期六1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHI5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A(同尾酶)现在是7页\一共有103页\编辑于星期六2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片段。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片段。现在是8页\一共有103页\编辑于星期六1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节

化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。现在是9页\一共有103页\编辑于星期六①

保护dNTP的3’端P和5’端–OH（1）原理1.磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。起始脱氧单核苷酸

加入的脱氧单核苷酸现在是10页\一共有103页\编辑于星期六②

带保护的单核苷酸连接带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来现在是11页\一共有103页\编辑于星期六③

用酸或碱的脱保护80%乙酸现在是12页\一共有103页\编辑于星期六（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。现在是13页\一共有103页\编辑于星期六原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法现在是14页\一共有103页\编辑于星期六

将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸连接处有三个酯键！现在是15页\一共有103页\编辑于星期六固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5’DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲基

),3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物C现在是16页\一共有103页\编辑于星期六目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成仪上自动进行的，DNA自动合成已采用的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合成效率高和副反应极少等优点，已经在自动合成仪被广泛采用。现在是17页\一共有103页\编辑于星期六3、亚磷酸三酯法(1)脱二苯甲基保护基加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4—二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5’—OH。(2)活化新的碱基核苷酸单体2的3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。现在是18页\一共有103页\编辑于星期六(3)缩合反应在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。(4)盖帽反应加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机会。(5)氧化反应形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价。现在是19页\一共有103页\编辑于星期六三价五价现在是20页\一共有103页\编辑于星期六如此经过多次循环，直到合成所需长度为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上洗脱下来，最后除去NH4OH，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯化分析。

要注意的问题:合成方向3’→5’核苷酸单体的磷酸基团在3’端亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。现在是21页\一共有103页\编辑于星期六化学合成的DNA片段一般在200bp以内。二、

化学合成DNA片段的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）现在是22页\一共有103页\编辑于星期六T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链现在是23页\一共有103页\编辑于星期六2.互补延伸连接法预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作为另一个片段延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA连接酶Klenow片段引物现在是24页\一共有103页\编辑于星期六1.直接合成基因三、

寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA

3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低现在是25页\一共有103页\编辑于星期六DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。人工接头用化学合成法合成的一段不等长双链DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性末端某种酶切所产生的粘性末端）。AATTCGGAATTC

CTTAAG现在是26页\一共有103页\编辑于星期六

将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第三节

目的基因的保存和扩增现在是27页\一共有103页\编辑于星期六（2）目前常用的载体

2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片段数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：

容量为

24kpcosmid载体：

容量为

50kbYAC：

容量为

1MbBAC:容量为

300kb现在是28页\一共有103页\编辑于星期六断点完全随机，片段长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。

①

物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片段。②

酶切法：现在是29页\一共有103页\编辑于星期六（2）载体与基因组DNA大片段的连接①

粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。现在是30页\一共有103页\编辑于星期六各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾现在是31页\一共有103页\编辑于星期六现在是32页\一共有103页\编辑于星期六4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）ln以e为底的对数现在是33页\一共有103页\编辑于星期六例如：人的基因组是

3×109bp，插入DNA片段的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105现在是34页\一共有103页\编辑于星期六1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、

cDNA文库的构建mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。现在是35页\一共有103页\编辑于星期六（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。现在是36页\一共有103页\编辑于星期六分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）现在是37页\一共有103页\编辑于星期六现在是38页\一共有103页\编辑于星期六反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物现在是39页\一共有103页\编辑于星期六用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一链3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH碱现在是40页\一共有103页\编辑于星期六剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’

cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

③cDNA第二链合成现在是41页\一共有103页\编辑于星期六④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

5’

3’

现在是42页\一共有103页\编辑于星期六现在是43页\一共有103页\编辑于星期六这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片段。妙用RNaseH小片段正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片段。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。现在是44页\一共有103页\编辑于星期六mRNAcDNA3’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

5’

引物mRNAcDNA第一链3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’

5’

RNaseHDNAligase去引物现在是45页\一共有103页\编辑于星期六现在是46页\一共有103页\编辑于星期六在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶现在是47页\一共有103页\编辑于星期六现在是48页\一共有103页\编辑于星期六6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n现在是49页\一共有103页\编辑于星期六三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析现在是50页\一共有103页\编辑于星期六第四节

目的基因的分离和扩增一、从mRNA分离目的基因1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。现在是51页\一共有103页\编辑于星期六纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotalmRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR现在是52页\一共有103页\编辑于星期六2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatitecolumn）现在是53页\一共有103页\编辑于星期六从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟基磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。现在是54页\一共有103页\编辑于星期六AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A的cDNA羟基磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟基磷灰石柱BAcDNA文库现在是55页\一共有103页\编辑于星期六3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的锚定引物Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

现在是56页\一共有103页\编辑于星期六（2）12种锚定引物AGTTTTTTTT5’

3’

CGTTTTTTTT5’

3’

GGTTTTTTTT5’

3’

TGTTTTTTTT5’

3’

AATTTTTTTT5’

3’

CATTTTTTTT5’

3’

GATTTTTTTT5’

3’

TATTTTTTTT5’

3’

ACTTTTTTTT5’

3’

CCTTTTTTTT5’

3’

GCTTTTTTTT5’

3’

TCTTTTTTTT5’

3’

现在是57页\一共有103页\编辑于星期六（3）5’端的随机引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

扩增cDNA。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二链，并PCR现在是58页\一共有103页\编辑于星期六（4）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。引物组合：240组在能分出20000多条带！实验结果：如果每条带相当于一种mRNA，20000mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。现在是59页\一共有103页\编辑于星期六（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。现在是60页\一共有103页\编辑于星期六二、PCR技术获得目的基因1.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据已知目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。(一)已知目的基因序列现在是61页\一共有103页\编辑于星期六原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增现在是62页\一共有103页\编辑于星期六（1）提取基因组

totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据已知目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。现在是63页\一共有103页\编辑于星期六目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的

基因cDNA第二链PCRmRNA现在是64页\一共有103页\编辑于星期六(二)未知目的基因序列（1）反向PCR扩增两个引物外侧的未知序列把线性DNA模板转变成环形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：现在是65页\一共有103页\编辑于星期六使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。现在是66页\一共有103页\编辑于星期六(2)盒式PCR盒式PCR（CassettePCR）是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。

现在是67页\一共有103页\编辑于星期六原理首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的酶切割，产生含上下游未知区域DNA分子，然后与含有对应限制酶切位点的Cassette进行连接，接着用Cassette引物1（C1）和根据已知区域设计的特异引物1（S1）进行第一次扩增，最后用Cassette引物2（C1）和根据已知区域设计的特异引物2（S2）进行第二次扩增。在设计上Cassette的5`端为-OH，所以目的DNA的3`末`端和Cassette的5`末端连接部位形成缺口。因此第一次PCR反应从引物C1开始延伸反应在连接部位终止，控制了非特异性扩增。只有从引物S1延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行扩增反应。再用内侧引物（C2，S2）进一步进行巢式PCR，高效特异地扩增目的DNA未知区域。现在是68页\一共有103页\编辑于星期六(3)RACE技术RACE（RapidAmplificationofcDNAends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3`或5`之间的未知序列的方法,分别称为3`-RACE或5`-RACE。锚定(AnchoredPCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术。现在是69页\一共有103页\编辑于星期六3`-RACE原理

TTTTT-Q1-Q05`AAAAA3`QTTTTTT-Q1-Q0第一链cDNAQT第一次扩增GSP1Q0第二次扩增Q1GSP2反转录图经典3`-RACE现在是70页\一共有103页\编辑于星期六5`-RACE原理第一链cDNA5`3`

ORF

GSP-RTGSP-RT逆转录cDNA加尾

第一链cDNAGSP-RTAAAA

第一次扩增Q1-TTTTAAAA第二次扩增Q1图经典5`-RACEGSP1GSP2现在是71页\一共有103页\编辑于星期六高特异性的5’-RACE原理高特异性的RACE基于反向PCR扩增技术,它利用已知序列内部高特异性的嵌套引物进行扩增的原理，故具有较高的特异性。AAAAAA3’已知序列Pi5’端磷酸化特异引物逆转录AAAAAA3’已知序列RNaseH降解掉mRNAT4RNALigase环化单链cDNAA2A1S1S2PCR1A1、S1PCR2S2、A2现在是72页\一共有103页\编辑于星期六三、转座子标签法转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA。原理转座子插入基因失活或突变构建纯合突变株基因组文库转座子为探针筛选出包含目的基因片段的阳性克隆目的基因片段为探针筛选野生型的植株构建的基因组文库测序现在是73页\一共有103页\编辑于星期六目的基因标签法×

转座子导入(含转座子的显性纯合体)AA*（隐性纯合体）aa

(显性表型)Aa

（突变或隐性表型）A*a自交aaA*a（突变纯合子）A*A*建基因文库目的基因对应的显性隐性性状个体都有现在是74页\一共有103页\编辑于星期六非目的基因标签法×

转座子导入(含转座子的显性纯合体)AA*（显性纯合体）AA

（突变或显性表型）A*A自交AAA*A（突变纯合子）A*A*建基因文库（显性纯合体）AA

关注的是一群因转座子插入引起突变的性状的基因，目的是筛选于某一性状相关的几个基因现在是75页\一共有103页\编辑于星期六转座子探针转座子标签法流程图

突变纯合子基因文库

转座子目的片段

亚克隆

PCR获得全长基因筛选

野生型植株基因文库全长目的基因

现在是76页\一共有103页\编辑于星期六四、图位克隆法图位克隆：根据目的基因在基因组上的位置特性而不是其编码产物来进行基因克隆。基因定位的基本步骤：1、通过DNA连锁分析、染色体缺失或平衡易位等方法将目的基因或其突变定位到染色体上。2、在目的基因的一侧或两侧确定一条或两条紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记，也可以是已知序列基因片段，两者统称为DNA分子标记。3、利用紧密连锁的分子标记序列作探针，通过染色体步移、染色体登陆等技术逐步逼近并最终将目的基因分离出来。现在是77页\一共有103页\编辑于星期六1、染色体步移染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。现在是78页\一共有103页\编辑于星期六●●●

筛选

已知的分子标记基因

未知的目的基因350kbYAC基因组文库分子标记探针筛选

阳性克隆a探针a探针b阳性克隆b重复筛选直到获得目的基因含目的基因的克隆图染色体步移筛选目的基因现在是79页\一共有103页\编辑于星期六2、染色体登陆如基因组文库的平均插入片段的长度大于目的基因与已知分子标记的物理距离，就可以通过筛库直接获得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移，这种方法称为染色体登陆。染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。现在是80页\一共有103页\编辑于星期六分子标记

Marker

目的基因

Targetgene

100kb探针

基因组文库

插入DNA≥100kb

阳性克隆进一步证实目的基因图染色体登陆筛选目的基因现在是81页\一共有103页\编辑于星期六第五节

酵母双杂交系统YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，纽约大学的S.Field等建立。现在是82页\一共有103页\编辑于星期六有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质二、酵母双杂交系统的原理许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。1.结构域（Domain）合作一、酵母双杂交系统的作用现在是83页\一共有103页\编辑于星期六例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因结合结合激活转录只要DNAbindingdomain（DNA-BD）与Activedomain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。实验发现：转录表达现在是84页\一共有103页\编辑于星期六2.拆开

DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因结合用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。不能转录现在是85页\一共有103页\编辑于星期六3.重组Domain用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：4.观察报告基因表达现在是86页\一共有103页\编辑于星期六上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因蛋白ADNAbindingdomain转录激活domain蛋白BGAL4的DBdomain与ADDomain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。不能转录（1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合现在是87页\一共有103页\编辑于星期六上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因蛋白ADNAbindingdomain转录激活domain蛋白B激活转录GAL4的DBdomain与ADDomain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。转录表达（2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合现在是88页\一共有103页\编辑于星期六双杂交原理X基因和Y基因产物的相互结合，导致reportergene表达。Reportergene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。现在是89页\一共有103页\编辑于星期六三、构建双杂交体系的宿主菌

删除基因组中的内源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。如：SFY526;HF7c等菌株。四、构建报告基因（reportergene）GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。此外还有其他营养缺陷。现在是90页\一共有103页\编辑于星期六1.穿梭质粒（shuttleplasmid）五、构建双杂交体系的穿梭质粒既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。2.双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。现在是91页\一共有103页\编辑于星期六靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。（1）B