实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯及分子量测定演示文稿

实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定演示文稿现在是1页\一共有60页\编辑于星期六优选实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定现在是2页\一共有60页\编辑于星期六实验内容1.溶菌酶的粗提取2.溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定3.溶菌酶纯度鉴定与分子量测定3现在是3页\一共有60页\编辑于星期六背景知识溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活4现在是4页\一共有60页\编辑于星期六5现在是5页\一共有60页\编辑于星期六6溶菌酶理化性质：相对分子质量14700Da，由129个氨基酸残基构，pI:~10.8，最适温度为50℃，最适pH为6～7左右。280nm的消光系数为13.0现在是6页\一共有60页\编辑于星期六7背景知识：酶的提取、分离纯化初步纯化（roughfractionation）（提取）：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。

高度纯化（finefractionation）（精纯化）：除去与产物性质相似的杂质。纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度现在是7页\一共有60页\编辑于星期六8

粗纯化（

提取）目标：

a.将目的酶最大限度地溶解出来。

b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。现在是8页\一共有60页\编辑于星期六9离心分离（一）基本原理1.离心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2N/60）2

N为离心机每分钟转数（r/min）；

Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。RCF=mr

（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用r平均代替

r平均=1/2（r大+r小）cm

现在是9页\一共有60页\编辑于星期六10

通常：低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。两者可换算或查测算图。现在是10页\一共有60页\编辑于星期六11名称

转速(r/min)

注意事项

低速离心机

6000

常温，注意样品热变性和离心管平衡

高速离心机

6000〜25000冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡

超速离心机

>25000冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡

离心机的种类

现在是11页\一共有60页\编辑于星期六12离心的形式角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。角式由低速到超速均有。现在是12页\一共有60页\编辑于星期六13角式离心机和离心头（转子）角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。现在是13页\一共有60页\编辑于星期六14离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖现在是14页\一共有60页\编辑于星期六15离心机操作平衡、定温、定速、定时。现在是15页\一共有60页\编辑于星期六16实验一、

溶菌酶的粗提取——略现在是16页\一共有60页\编辑于星期六17酶精纯化常用技术膜分离技术柱层析技术蛋白质结晶透析超滤凝胶过滤（分子筛/排阻）层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析反相层析现在是17页\一共有60页\编辑于星期六18PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity

ReversedPhase现在是18页\一共有60页\编辑于星期六实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定目的：1.掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原件。2.掌握层析柱填装方法及层析填料的保存3.掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活19现在是19页\一共有60页\编辑于星期六原理：

根据溶菌酶pI10.8，pH8.0

PBS中携带？电，与阴/阳离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟）OD600值的下降评价酶活性。溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下，OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。280nm的消光系数为13.0，根据A=ECL可粗略测定溶菌酶浓度，用于酶比活的评价。20现在是20页\一共有60页\编辑于星期六21离子交换层析

（ionexchangechromatography，IEC）现在是21页\一共有60页\编辑于星期六222.离子交换填料：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。

纤维素琼脂糖葡聚糖

载体电荷基团—O—CH2—COO-—Na+反离子1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。现在是22页\一共有60页\编辑于星期六23离子交换剂--带有电荷基团的不溶性载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载体Diethylaminoethyl(DEAE)

阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质)

阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)现在是23页\一共有60页\编辑于星期六24两种离子交换剂阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3现在是24页\一共有60页\编辑于星期六25

化学原料合成：sephadexsepharose载体

天然材料制成：cellulose

如：DEAE-Sepharose，CM-Sepharose现在是25页\一共有60页\编辑于星期六26

实验设计原理利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。pH8.0pI>8.0蛋白质带正电pI<8.0蛋白质带负电溶菌酶pI:~10.8现在是26页\一共有60页\编辑于星期六272.阴离子交换剂分离蛋白质的过程平衡吸附去吸附分离结束再生+低盐高盐利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-现在是27页\一共有60页\编辑于星期六283.操作平衡上样冲洗洗脱再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:

增加溶液的离子强度

梯度洗脱法

（连续、不连续）改变溶液的pH值

3）再生：0.5-1mol/LNaCl溶液处理。4.应用制备纯化生物大分子现在是28页\一共有60页\编辑于星期六29梯度洗脱方式现在是29页\一共有60页\编辑于星期六30图4-39梯度溶液的制备方法和洗脱曲线（a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度现在是30页\一共有60页\编辑于星期六31

层析柱的制备与层析操作

柱层析的设备:

层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。现在是31页\一共有60页\编辑于星期六32层析设备层析装置：梯度混和器蠕动泵层析柱监测仪记录仪收集器

现在是32页\一共有60页\编辑于星期六33记录仪现在是33页\一共有60页\编辑于星期六现代化层析设备

——AKTA层析柱XKBPG现在是34页\一共有60页\编辑于星期六实验2.1层析柱的填装1.观摩2.实验步骤1）测定酶浓度（S-2）C(mg/ml)=A280/132）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg蛋白需要的填料量和量取量。35现在是35页\一共有60页\编辑于星期六3）装柱要点：a.用纯水将乙醇保存液置换b.柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。c.填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底d.柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中。36现在是36页\一共有60页\编辑于星期六二、酶的活力单位及酶活测定：1.酶活单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。

现在是37页\一共有60页\编辑于星期六382.酶的比活力：

每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示；对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。很明显，比活力越大，酶的活力越大。现在是38页\一共有60页\编辑于星期六分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。测压法：产物中有气体，测气压增加量。滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。

除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。3.具体测定方法

现在是39页\一共有60页\编辑于星期六4.回收率和纯化倍数回收率＝×100％提纯后酶总活力提纯前酶总活力纯化倍数＝每次比活力第一次比活力现在是40页\一共有60页\编辑于星期六41实验2.2溶菌酶的活性测定实验材料：1.枯草芽孢杆菌悬液2.S1，S23.PBS等4.分光光度计、比色皿、计时器、离心机等现在是41页\一共有60页\编辑于星期六42实验步骤：1.取6ml菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀6mlPBS重悬。2.测定OD600并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释）3.测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加入）比色皿1234PBS缓冲液/ml5---细胞PBS悬液/ml-54.84.8酶液S1/ml--0.2酶液S2/ml0.2现在是42页\一共有60页\编辑于星期六43实验步骤：4.酶活性测定，以①管（PBS）为对照，每隔30s测定2,3,4管的OD600并记录5.酶活力及比活性计算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136.纯化回收率及纯化倍数计算时间（s）03060901201501802号

3号

4号

回收率＝×100％US2*V2US1*V1纯化倍数＝S2比活力S1比活力现在是43页\一共有60页\编辑于星期六44样品体积ml蛋白浓度mg/ml总蛋白

mg活力

u/ml比活力

u/mg总活力

U回收率%提纯倍数S1V1＝

1001S2V2＝

7.完成下表现在是44页\一共有60页\编辑于星期六45实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定实验目的:1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；2、掌握电泳原理以及SDS垂直板电泳分析蛋白质技术；3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，SDS分子量测定图谱的绘制与计算；4、了解在电泳中分子量标准物的使用。现在是45页\一共有60页\编辑于星期六46SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）测定。1.原理现在是46页\一共有60页\编辑于星期六471.原理

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。现在是47页\一共有60页\编辑于星期六48

SDSseparatesproteinsbyMW现在是48页\一共有60页\编辑于星期六49

蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。现在是49页\一共有60页\编辑于星期六50现在是50页\一共有60页\编辑于星期六512.分离效应

PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应

连续PAGE现在是51页\一共有60页\编辑于星期六不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

现在是52页\一共有60页\编辑于星期六532.实验步骤：（SDS）1）母液配制2）制胶准备:

玻璃板清洗、干燥制胶架的准备：严格按说明书组装制胶架注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动及其他设施偏离工作要求。现在是53页\一共有60页\编辑于星期六542.实验步骤：（SDS）3）制胶:

分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择15%的分离胶，如表配制现在是54页\一共有60页\编辑于星期六55浓缩胶（10ml）双蒸水0.5mol/LpH6.8Tris-HCl30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP5%3.4ml0.63ml0.83ml50μl5μl50μl分离胶（20ml）双蒸水1.5mol/LpH8.8Tris-HCl胶贮液10%SDSTEMED10%AP12%3.3ml2.8ml2.5ml2.0ml4ml5ml100μl4μl100μl现在是55页\一共有60页\编辑于星期六563、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平