蛋白质的分离纯化-2课件

蛋白质的理化性质及分离纯化第一节蛋白质的理化性质第二节蛋白质的分离纯化第三节蛋白质的分子量测定第四节蛋白质的含量测定与纯度鉴定第一节蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的紫外吸收性质四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的呈色反应三、蛋白质的胶体性质和沉淀二、蛋白质的紫外吸收性质蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力的强弱顺序为：色（Trp）>酪（Tyr）>苯丙（Phe）三、蛋白质的胶体性质和沉淀蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种稳定的亲水胶体（具有水化层和双电子层）。蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔效应以及不能通过半透膜。半透膜：多是由用赛咯吩（cellophane）制造，赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。（一）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的沉淀

蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变,破坏了蛋白质的稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。

沉淀蛋白质的方法有以下几种:中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法.2.有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(如甲醇,乙醇或丙酮等)引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。3.重金属盐沉淀法当溶液pH大于等电点（pI）时,蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)结合成不溶性盐而沉淀。应用：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救,然后再服用催吐剂排出体外。4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：如：鞣酸（单宁酸,tannicacid)钨酸(tungsticacid，H2WO4)、苦味酸(picricacid)即2,4,6-三硝基酚,碘化钾等。某些酸类:三氯醋酸,磺基水杨酸（sulfosalicylicacid）和硝酸等.

当pH<pI，蛋白质带正电荷与生物碱试剂某些酸根负离子

不溶性沉淀反应四、蛋白质的变性和复性蛋白质变性的定义：

环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的改变，这一过程称为蛋白质变性。蛋白质的复性：蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。蛋白质变性后的特性：

生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变五、蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应反应名称试剂颜色反应有关基团双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键

酚试剂反应碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基第二节蛋白质的分离纯化二、蛋白质的分离纯化方法主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的生物学亲和力（一）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法主要方法：1：透析（dialysis）和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法1：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）超过滤装置

使用压力或者离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。装好具备密度梯度的介质溶液离心收集分离后的各组分加入：混和蛋白质样品离心装置2：密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法

凝胶过滤是按照蛋白质分子大小进行分离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶过滤分离蛋白质的流程开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来洗脱收集上样样品上柱后，样品中的小分子可以进入凝胶微孔，但是大分子不能进入。这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸收峰。2.蛋白质的盐溶和盐析盐溶（salting-in）

：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。盐析（salting-out）

：当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。3.有机溶剂分级分离法与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。4.改变温度分离蛋白质0~40oC之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，

例外：0～25oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。40~50oC以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。一般蛋白质的分级分离操作一般都在0~4oC温度下进行。（三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法主要方法：

电泳离子交换层析电泳概述由于蛋白质在指定的PH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在电场中泳动速度不同。因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。1.聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamindegelelectrophoresis)PAGE电泳它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板（不连续体系）。凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的浓缩胶分离胶样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）分离成单区带SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)

SDS:是用SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸3－5分钟）。通过加热和SDS可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单亚基。二硫键被切断。

SDS是带有负电荷的分子，所有结合SDS的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。浓缩胶分离胶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置点样浓缩胶分离胶样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置2.毛细管电泳①泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。②用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量5～30μl1mg/ml溶液。3.等电聚焦电泳等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。等电聚焦可以把人的血清分成40多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02（甚至<0.02）pH单位的差别就能分开。实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。等电聚焦电泳装置当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI

相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。4.蛋白质的双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）

将等电聚焦电泳与SDS结合起来的电泳技术。电泳方向电泳方向等电聚焦电泳SDS双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。特种多缓冲交换剂PH降低混和蛋白质样品特种多缓冲液特种多缓冲液收集特种多缓冲液收集特种多缓冲液依次收集不同的蛋白组分5.层析聚焦(P310)填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。支持介质：

对蛋白质交换容量大阳离子交换剂阴离子交换剂CM—纤维素(弱酸型)P纤维素(中强酸型)SE纤维素(强酸型)SPSephadex(强酸型)AM—纤维素(弱碱型)PAB--纤维素(弱碱型)DEAE-纤维素(中强碱型)DEAE-Sephadex(中强碱型)TEAE-纤维素(强碱型)QAESephadex(强碱型)6.离子交换层析(P310)以阳离子交换型树脂为例将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-Na＋（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂（固定相）填充到层析柱中。将含有样品的流动相加入层析柱中，样品中带有正电荷的蛋白质X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果X与Na＋交换（阳离子交换），形成SO3-X，蛋白质就结合到了层析柱上。在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的pH，或是同时采用这两种方法，就可以将结合于树脂上的蛋白质X成分，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地洗脱下来。结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式：洗脱方式恒定浓度洗脱改变盐浓度或pH洗脱跳跃式分段洗脱渐进式连续改变(梯度洗脱)简单型混合器复合型混合器利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。

典型的吸附剂：硅胶,氧化铝和活性炭等.

主要用来分离非离子、水不溶性化合物（四）利用选择性吸附的纯化方法(P312)

亲和层析(affinitychromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力,即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。(五)利用与配体的特异生物学亲和力的纯化方法(P313)亲和层析

把某一待纯化蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶这一类的载体表面。

向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化的蛋白质由于与载体上的配体结合而被吸附，而其它蛋白质和杂质成分通过平衡液的洗涤可以被除去。

被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液（高浓度洗脱液）洗脱(亲合洗脱)并进行收集。样品层析柱凝胶上的配体样品中待分离的的蛋白成分蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的样品成分被平衡液洗脱下来。样品凝胶上的配体样品中能与配体特异结合的蛋白成分高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物蛋白质的分离纯化方法分子大小：溶解度：电荷：吸附性质：对配体分子的亲和力：透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法等电点和PH值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度电泳、离子交换层析亲和层析第三节蛋白质分子量的测定(P291-299)一、根据化学组成测定最低相对分子质量

用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量,可以计算出蛋白质的最低相对分子质量。如Fe，并假设每个蛋白质分子中只有1个Fe原子，则由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。例如:某种蛋白含铁量为0.335%,其最低相对分子质量(假设此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白)可按下式计算出:若此蛋白含4个铁原子（如血红蛋白），则：Mr=16700×4＝86600最低相对分子质量Mr铁的原子质量铁的百分含量=55.80.335×100=×100=16700即某蛋白的真实

Mr=16700×n（n为含有的铁原子的数目）渗透现象：溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向的净移动现象。二、根据渗透压法测定相对分子质量半透膜溶剂蛋白质溶液渗透压h渗透压测定的装置小分子可以通过，但蛋白质等大分子不能通过。Mr=

RTlim(/c)c0R:气体常数；T：绝对温度；：渗透压；c:溶质的浓度。注意事项：尽量采用等电点或者接近等电点的缓冲溶液做为半透膜内外的溶剂，以避免PH值对渗透压的影响。渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：优点：装置简单，准确度相对高。缺点：不能区别所测蛋白质溶液中的蛋白质样品是否均一。如果溶液含多种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。（三）蛋白质的扩散和扩散系数扩散（平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散系数D：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。扩散系数D的特点：(2)扩散系数一般不单独用来决定Mr,但如后面所说的与沉降系数结合起来,可以给出蛋白质的精确相对分子质量。(1)随Mr的增加而降低,但扩散系数对Mr的变化并不敏感。

（四）沉降分析法测定相对分子质量需转速为60,000～80,000rpm的超速离心机

测Mr常用两种方法：沉降速度法沉降平衡法沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的速度与蛋白质的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。1.沉降速度法测定相对分子质量沉降系数(s):单位离心场的沉降速度。液面界面溶剂坪区池底界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之后就会出现几个界面。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。如人血红蛋白沉降系数s=4.46S，即4.46×10－13秒。为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算成标准条件下的s值。沉降系数的标准条件定为20C,溶剂为水。校正后的沉降系数用s20，w表示。

大部分生物大分子的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围。因此：把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位或称沉降系数单位，用S(大写)来表示。

即：1S＝10-13秒Mr=RTsD（1－Vρ）R:气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T:绝对温度D

:扩散常数（可用试验求得）V

:蛋白质的偏微比容（m3·g-1）ρ:溶剂密度（20℃，g·ml-1）

s

:沉降系数（可以根据沉降速度和离心力求得）蛋白质分子量与沉降系数的关系2.沉降平衡法测定相对分子质量利用较低转速（8000~20000r/min）进行。由于分子颗粒沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。x2x1离心力离心池轴心液面扩散力蛋白质的沉降平衡

2RTdln(c2/c1)(1-)2(x22-x12)Mr=R:气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T:绝对温度V

:蛋白质的偏微比容（m3·g-1）ρ:溶剂密度（20℃，g·ml-1）:转子的角速度。c1、c2:距离旋转中心x1和x2处的蛋白质浓度。x2x1离心力轴心液面扩散力利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来（五）凝胶过滤法测定相对分子质量洗脱过程凝胶球如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积（elutionvolume）,则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径,称蛋白质分子的斯托克半径。因此,标准蛋白质(已知Mr和斯托克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的Mr。注意：分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质,则不能用此方法测定Mr。Gelfiltrationcolumn1966年Andrews提出了一个经验公式VeVo=

a-blgMr其中：Ve为洗脱体积；Vo为外水体积

Mr为相对分子质量；a和b为常数①方法简便，仪器简单。②不纯样品亦可，只要找出活性峰位置（Ve）即可。lgMrVea

1VebbVo

lgMr=_做直线图(六)SDS－PAGE法测定相对分子质量

SDS处理蛋白质之后，所有的SDS-蛋白质复合物都带有了大量的负电荷，而且分子都呈现统一的长椭圆形。

SDS电泳时SDS-蛋白质