流式细胞术在临床与科研中应用

流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。

FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器.

流式细胞术第一页，共48页。EPICSXL流式细胞分析仪第二页，共48页。FC500第三页，共48页。常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670免疫荧光红TO488 525RNA染色绿第四页，共48页。DualParameterHistograms第五页，共48页。应用分类1、免疫表型分析2、DNA含量及细胞周期分析3、定量分析4、细胞功能分析5、凋亡研究6、其它方面第六页，共48页。免疫表型分析1993年在波士顿召开的人类白细胞分化抗原会议（leukocytedifferentiationantigen,HLDA）将CD抗原(clusterofdifferentiation)分为T细胞、B细胞、髓细胞、血小板、内皮细胞、自然杀伤细胞、活化抗原、黏附因子、细胞因子和细胞因子受体等九个组，确立了48种新抗原。1996年11月在神户召开的第六届HLDA会议上，又有30多种新抗原被确认，CD编号已达166个，CD抗原有197种。2000年7月，第七届人类白细胞分化抗原会议的召开，CD抗原已达247种。第七页，共48页。生物学我们想做什么?细胞群–淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,血小板,etc.抗原组合多少?共表达?表达密度?抗原分布表面胞内第八页，共48页。CD3CD8需要用多少的标志来确证感兴趣的细胞群?它们在细胞上的分布是不是很近?它们是构成性表达和调节性表达?它们是否在不同的细胞上表达不同?他们表达强还是弱?抗原表达:

ImportantforoptimalconfigurationCD3CD4CD3CD8第九页，共48页。抗原分布:

Importantformethodoptimization表面,胞浆,核内是共同检测还是分别检测?表面胞浆核内CD3,CD4,CD8,tetramercytokinesDNACD3,4,8,tetramer+CytokinesCD3,4,8,tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8,tetramer+Cytokines+DNA第十页，共48页。CD系列在免疫学中常被用于：

（1）CD抗原的基因克隆，新CD抗原及新配体的发现；（2）CD抗原功能与结构的关系（3）细胞激活途径和膜信号的传递；（4）细胞分化过程中的调控；（5）细胞亚群的功能。

第十一页，共48页。1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系4.干祖细胞的定量及成分分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋白的分析等等。临床与科研常见应用第十二页，共48页。淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫

CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞

CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高

CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达

/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞

当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低

CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞

病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高

感染时升高第十三页，共48页。淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高

CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高

CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞

NK细胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高

CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆

第十四页，共48页。淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺陷病爱滋病病毒感染传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障碍性贫血粒细胞减少症第十五页，共48页。监测细胞免疫状态

1.CD4+、CD8+T细胞减少：见于r免疫球蛋白缺乏症、胸腺

发育不良、严重联合免疫缺陷病。2.CD8+T细胞增多见于病毒感染：HBV、CMV、EB等。3.CD4+/CD8+比例异常：进展期AIDS：CD4+细胞减少，CD8+细胞可以正常、增高或降低，比值下降；身免疫性疾病，如多发性硬化，CD4+/CD8+升高，CD8+减少；SLE病人的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官的侵犯程度。

ABMT后免疫重建期间可有CD4减少，比值下降。风湿性关节炎关节液中CD4+CD29+细胞增多。多发性硬化（MS）、SLE患者外周血CD4+CD45RA+细胞减少。

第十六页，共48页。

4，CD3/HLA-DR：同时计数外周血静止T细胞（CD3+HLA-DR-）、B细胞（CD3-HLA-DR+）及活化T细胞（CD3+HLA-DR+）。

5，CD3/CD16+56：计数总NK细胞群（CD3-CD[16+56]+）。NK细胞是机体抗肿瘤、寄生虫、病毒等感染的重要免疫因素，也参与第II型超敏反应和移植物抗宿主反应，IL-2治疗后，外周血NK细胞增加。

6，移植后免疫监测：测定细胞表面活化抗原的表达,可以预测移植排斥和移植后感染:

CD25+高于正常5--10%,表明即将发生或已发生排斥;

CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染,比值<0.2必须停用免疫抑制剂.

CD2+HLA-DR+增加5--10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染.第十七页，共48页。变态反应性疾病CD19与CD23的检测鉴别支气管炎与哮喘CD203变态反应性疾病CD203增强CD63CD63与支气管炎的疾病进程黏附分子第十八页，共48页。

白血病免疫分型的价值确定ALL的细胞类型（B细胞或T细胞）和ALL的分化阶段。鉴定AML的特征。对形态学上未分化的急性白血病有助于鉴定细胞类型。诊断一些少见类型的白血病。如：M6、M7、M0等。第十九页，共48页。

诊断双表型/混合细胞型急性白血病。鉴别诊断ALL伴有髓系抗原表达（My+）或AML伴有淋系抗原表达（Ly+）。鉴别急性白血病与其他造血系统和非造血系统恶性肿瘤。根据一些特殊的免疫表型特征诊断与某核型异常相关的亚型。如：M3/t(15;17);M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。第二十页，共48页。HLA-B27检测

外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊柱炎的发生有很大程度的相关性.循环血中活化血小板（CD62P、CD63）：

糖尿病伴微血管病变、冠心病、高血压病、高脂血症、脑血栓形成、短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化患者活化血小板百分率和绝对值显著高于正常人。而糖尿病无微血管病变、周围血管病变以及深静脉血栓形成患者活化血小板水平与正常人无显著差异。PTCA后24小时发展成急性血管闭塞或高度再狭窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于预测PTCA后急性缺血再发作的危险性。

第二十一页，共48页。PNH(阵发性睡眠性血红蛋白尿)第二十二页，共48页。HbF(胎儿血红蛋白)检测第二十三页，共48页。HbF(胎儿血红蛋白)检测第二十四页，共48页。热门研究抗原特异性T细胞检测树突状细胞（DC）循环微转移肿瘤细胞TLR1、TLR2、TLR4等第二十五页，共48页。MHCTetramerTechnology第二十六页，共48页。微转移肿瘤细胞灵敏度:10-7第二十七页，共48页。

临床应用疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据免疫调节：细胞因子/受体的相互作用共刺激分子受体/配体的相互作用

发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递障碍有关药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果的监测免疫状态评价：移植、放化疗等.第二十八页，共48页。细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及细胞周期分析第二十九页，共48页。G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle第三十页，共48页。0

200

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600

80010002N4NCountsG0/G1G2/MS异倍体PI荧光强度(DNA含量)流式DNA周期示意图第三十一页，共48页。淋巴瘤组织学分级与DNA倍体及

S期细胞关系HistologyDNAAnalysisS期比值(%)Low-gradeDiploid/Aneuploid1~5Intermediate-gradeFrequentlyAneuploid5~15High-gradeFrequentlyAneuploid>15第三十二页，共48页。

依据Workingformulation之分类，Low-gradeNHL中有47%为Aneuploid在Intermediate-gradeNHL中有71%为Aneuploid；而High-gradeNHL中有90%为Aneuploid

DNA含量；很显然使用FCM也有助于NHL的诊断与分类，不过Aneuploid是否对预后有影响，则仍有待研究。有人认为高SPF是最重要的不良预后指标。第三十三页，共48页。癌前病变

人体组织细胞在转化过程中，均伴随着细胞DNA含量的异常改变，癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致，而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平衡关系，FCM通过精确确定DNA含量，能对癌前病变的性质和发展趋势作出判断，有助于癌变的早期诊断。

DNA非整倍体的出现可能是恶变细胞的重要标志，目前病理学尚无法从中发现癌变和即将癌变的细胞，而FCM检测中细胞DNA非整倍体的出现可做为一个有价值的参数。第三十四页，共48页。1.肿瘤的早期诊断。2.肿瘤的良恶性判断。3.观察细胞的增殖状态及周期分布。4.疗效监测第三十五页，共48页。细胞功能分析

1.吞噬功能试验

2.氧爆发试验3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液免疫的II型细胞.4.药物泵的功能检测

5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测6.血小板的粘附,聚集功能检测：

纤原或GPIIb-IIIa上纤原受体的缺陷均可引起血小板聚集障碍而出血。应用纤原单抗(如SZ65)及ADP等诱导剂，在FCM上观察纤原结合的百分率及荧光强度，可为该疾病的诊断提供参考依据.第三十六页，共48页。细胞凋亡细胞凋亡是细胞的一种基本生命现象，贯穿于个体的生长、发育直至死亡的整个生理过程。它与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用，且在胚胎发育、免疫系统的克隆选择、神经系统、造血系统的发育过程中扮演至关重要的角色；其病理学作用可涉及癌症、自身免疫疾病、HIV及退行性神经疾病如Alzheimer和Parkinson病等。正因为如此，与其相关的基因和分子的研究成为当今生命科学领域的一个焦点第三十七页，共48页。Introductionofapoptosispathway第三十八页，共48页。细胞凋亡研究

1.鉴别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI2.测定凋亡率:AnnexinⅤ、Apo2·7、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas