SOD检测波长的选择及含量测定课件

实验七SOD检测波长的选择及含量测定一、超氧化物歧化酶的基本特性

及生理功能1、超氧化物歧化酶的组成超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）是一种能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶，按金属辅基不同分为三类：Cu,Zn-SODMn-SODFe-SOD

自由基：是一类非常活跃的化学物质，人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。它可聚集体在人体各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是[万病之源]，是人体健康的大敌。

2、超氧化物歧化酶的生理功能（1）延缓由于自由基侵害引起的衰老现象（2）治疗由自由基损伤而诱发的疾病（3）消除肌肉疲劳（4）提高人体的抵抗力在选择方法时应考虑的几点因素①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、紫外分光光度法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

二、双缩脲法（Biuret法）

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基（-CONH2）或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定波长为540nm，测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。四、考马斯亮兰法（Bradford法）

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

SOD检测波长的选择及含量测定实验目的掌握SOD检测波长的选择方法学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。掌握考马斯亮兰法测定蛋白质含量的实验技术。

本实验采用考马斯亮蓝G-250法测定SOD浓度。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色，它和蛋白质通过范德华力（Vanderwals′bond）结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer′slaw）。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。实验原理1.SOD检测波长的确定准确称取SOD粉末10mg，用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml蛋白溶液，作为标准储备液Ⅰ。从上述储备液Ⅰ中吸取两份，每份0.4ml，分别放置在试管中，其中一份加入0.15mol/LNaCl溶液5ml，摇匀后备用；另一份中先加入0.15mol/LNaCl溶液0.6ml，再加入5ml考马斯亮兰试剂，1h内以0.15mol/LNaCl溶液为空白分别进行全波长扫描，并记录最大吸收波长。实验步骤2.SOD标准曲线的制作

取已配制好的标准储备液Ⅰ备用。取6支试管，按下表操作。试管编号0123451mg/mlSOD溶液/ml00.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/ml1.00.80.70.60.50.4考马斯亮兰试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色SOD标准曲线3.样品测定精密吸取1mg/ml的SOD溶液0