抗生素类药物分 析

主要内容概述β-内酰胺类抗生素氨基糖苷类抗生素第一页，共63页。学习要求1.掌握抗生素类药物的类型、结构、质量和稳定性特点以及分析方法2.熟悉各类抗生素药物的有关来源、特点和检查方法第二页，共63页。第一节概述

一、抗生素药物的定义和特点

1.定义：是生物（包括微生物、植物、动物）在其生命活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），能在低微浓度下有选择得抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。2.特点：

化学浓度低（同系物多、异构体多、降解物多）

活性组分易发生异变（微生物菌株和发酵条件的改变）

稳定性差（含有活泼基团）第三页，共63页。二、抗生素类药物的分类1.根据产生抗生素的生物来源分类2.根据抗生素的作用对象分类3.根据抗生素的作用机制分类4.根据抗生素的化学结构分类★（1）β-内酰胺类抗生素★（2）四环类抗生素★（3）氨基糖苷类抗生素（4）大环内酯类抗生素第四页，共63页。（5）多烯环类抗生素（6）多肽类抗生素（7）酰胺醇类抗生素（8）抗肿瘤类抗生素（9）其他类抗生素第五页，共63页。三、抗生素类药物的细菌耐药性1.耐药性的种类固有耐药性和获得性耐药性2.耐药性的机制（1）产生灭活酶，使抗菌药失活（β-内酰胺酶，氨基糖苷类抗生素钝化酶，其他酶）（2）抗菌药物作用靶位的改变（3）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统第六页，共63页。四、抗生素药物的质量分析（一）鉴别试验官能团的颜色反应（β-内酰胺环的羟肟酸铁反应）光谱法（IR、UV）色谱法（TLC和HPLC）生物学法（二）检查1.影响产品稳定性的检查项目结晶性、酸碱度和水分等2.控制有机和无机杂质的检查项目有关物质、残留溶剂、颜色、炽灼残渣、重金属等3.与临床安全性密切相关的检查项目异常毒物、热原或细菌内毒素、降解物质、无菌等4.其他项目组分分析等第七页，共63页。（三）含量或效价测定

1.生物检定法（管碟法和浊度法）：通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

优点

缺点灵敏度高，与用量少操作步骤多与临床应用要求一致测定时间长适用范围广测定误差大第八页，共63页。2.理化方法：主要是HPLC法是根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理性质及反应而进行的。优点：迅速、准确地测定效价；较高专属性。缺点：只能测定药物的总含量，不一定能代表抗生素的生物效价；易受杂质干扰。第九页，共63页。3.抗生素活性表示方法：

以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价基准：同一种抗生素的各种效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。一种抗生素有一种效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类换算。第十页，共63页。第二节β-内酰胺类抗生素一、化学结构和性质1.化学结构青霉素和头孢菌毒素分子中都有有个游离羧基和酰胺侧链。第十一页，共63页。

母核（6-氨基青霉烷酸）青霉素类

第十二页，共63页。头孢菌素类AB第十三页，共63页。2.性质（1）β-内酰胺环的不稳定性：四元环张力大，酰胺键易水解。干燥条件：稳定；水溶液：不稳定（2）旋光性：手性C。青霉素类C、C

、C。头孢菌素类C、C。（3）酸性和溶解性：游离羧基。与有机碱成盐难溶于水，与碱金属成盐易溶于水。（4）紫外吸收特性：共轭系统第十四页，共63页。青霉素的降解反应第十五页，共63页。头孢菌素类酸、碱、胺类-内酰胺酶降解失效第十六页，共63页。二、鉴别试验（一）色谱法（对照品对照法）（1）TLC法对照品相同条件比较Rf供试品颜色斑点（2）HLPC法对照品相同条件比较保留时间供试品

、第十七页，共63页。（二）光谱法1.红外吸收光谱IRβ-内酰胺环羰基1750~1800cm-1仲酰胺的氨基、羰基3300cm-11525cm-11680cm-1羧基离子1600cm-11410cm-1以阿莫西林为例第十八页，共63页。第十九页，共63页。2.紫外吸收光谱UV最大吸收波长最大吸收波长的吸光度如：头孢唑啉钠λmax=272cm

第二十页，共63页。三、呈色反应1.异羟肟酸铁反应β-内酰胺环破裂

第二十一页，共63页。2.类似肽键的反应-CONH-（1）茚三酮反应茚三酮α-氨基紫蓝色第二十二页，共63页。（2）双缩脲反应-CONH-似肽键

碱性酒石酸铜β-内酰胺类紫

（开环分解）第二十三页，共63页。3.其他呈色反应（1）重氮-偶合反应

重氮苯磺酸试液-C6H5-OH橙黄色

（偶合）（2）与变色酸-硫酸、硫酸-甲醛等反应第二十四页，共63页。（四）各种盐反应

Na+：焰色鲜黄色加入醋酸氧铀锌黄色沉淀K+：焰色紫色加入0.1%四苯硼钠+醋酸白色沉淀第二十五页，共63页。三、检查（一）聚合物分子排阻色谱法定量方法：主成分自身对照法面积归一化限量法自身对照外标法第二十六页，共63页。例：青霉素V钾中青霉素V聚合物的测定固定相：葡聚糖凝胶G-10（40~120µm）

流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液

流动相B：水对照品溶液：头孢他啶对照100µg/ml~200µg/ml第二十七页，共63页。

1）系统适用性试验：理论塔板数用1mg/ml蓝色葡聚糖2000计算均不低于400；重复性用对照品溶液、流动相B测定。保留时间生物比值均在1.93~1.07之间，拖尾因子均小于2.0，峰面积的RSD应小于5.0%。

2）测定方法

进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含青霉素V聚合物以青霉素V计不得超过0.3%第二十八页，共63页。（二）有关物质和异构体

例：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

固定相：ODS

流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）检测波长：278nm

1）头孢呋辛酯Δ2-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相头孢呋辛酯Δ2-异构体。

2）系统适用性试验：各异构体之间的R>1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。第二十九页，共63页。3）异构体：t‘R1

相对保留时间r12=-----1----被测物

t’R22----标准物异构体相对保留时间判断B异构体0.85供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体1.0与A、B异构体峰面积和之比应为0.48~0.55。第三十页，共63页。（三）吸光度杂志吸光度方法（四）有机溶（五）结晶性

结晶质和非结晶质第一法（偏光显微镜法）第二法（X射线粉末衍射法）第三十一页，共63页。四、含量测定（一）高效液相色谱法ChP内标法＋校正因子外标法特点

快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）例：头孢克洛阿莫西林克拉维酸钾分散片第三十二页，共63页。egChp头孢克洛含量的HPLC测定法色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液-乙腈（92:8）为流动相，检测波长为254nm。取头孢克洛对照品及头孢头孢克洛δ-3-异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中分别含头孢克洛及头孢克洛δ-3-异构体约0.2mg的混合溶液，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰的分离度应符合要求。第三十三页，共63页。测定法：取本品约20mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢克洛对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中C15H14ClN3O4S的含量。规定按无水物计算，含C15H14ClN3O4S不得少于95.0%。第三十四页，共63页。（二）生物样品中β-内酰胺类抗生素的分析色谱法、微生物法、放射免疫法、HPLC法第三十五页，共63页。第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素第三十六页，共63页。一、化学结构和性质

（一）化学结构链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺苷元链霉双糖胺糖第三十七页，共63页。链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺第三十八页，共63页。巴龙霉素D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖巴龙胺苷元巴龙二糖胺糖

第三十九页，共63页。D-葡萄糖胺脱氧链霉胺D-核糖巴龙霉糖第四十页，共63页。庆大霉素糖

苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺

糖

第四十一页，共63页。绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺第四十二页，共63页。庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=H

R1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3第四十三页，共63页。（二）性质多与硫酸成盐链霉素

3个庆大霉素5个碱性中心碱性1.水溶性溶解性（二）第四十四页，共63页。2.旋光性多个氨基糖3.苷的水解与稳定性水解为一分子苷元和一分子双键。稳定：链霉素pH5～7.5庆大霉素pH2～124.紫外吸收光谱第四十五页，共63页。二、

鉴别

茚三酮反应（一）△羟基胺结构第四十六页，共63页。

Molisch试验（二）氨基糖苷类H+糠醛羟甲基糠醛-萘酚蒽酮呈色第四十七页，共63页。1.α-萘酚呈色原理第四十八页，共63页。2.蒽酮的呈色原理第四十九页，共63页。（三）N-甲基葡萄糖胺反应例：取本品约10mg,加水1ml,溶解后,加盐酸溶液（9→100）2ml,在水浴中加热10min,加8%氢氧化钠溶液2ml与2%乙酰丙酮水溶液1ml,置水浴中加热5min,冷却后，加对二甲基苯甲醛试液1ml,即呈樱桃红色。

第五十页，共63页。（四）麦芽酚反应链霉素的特征反应例硫酸链霉素的麦芽酚反应鉴别：取本品约20mg,加水5ml溶解后,加氢氧化钠试液0.3ml,置水浴上加热5min,加硫酸铁铵（取硫酸铁铵0.1g,加0.5mol/L硫酸溶液5ml溶解）0.5ml,即成紫红色。第五十一页，共63页。（五）坂口反应链霉素水解产物链霉胍的专属反应（六）硫酸盐反应第五十二页，共63页。（七）色谱法1.TLCChp2010采用TLC法对本类抗生素进行鉴别。薄层板：硅胶G展开剂：三氯甲烷-甲醇-浓氨水显色剂：茚三酮或碘蒸气例:硫酸庆大霉素注射液取本品与庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，作为供试品溶液和标准品溶液，照TLC试验，吸取上述两种溶液各20ul,分别点于同一硅胶G薄层板（临用前于105℃活化2h）上；另取三氯甲烷-甲醇-氨溶液（1:1:1）混合振摇，放置1h,分取下层混合液为展开剂，展开，取出于20~25℃晾干置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液斑点数、位置和颜色相同。第五十三页，共63页。

2.HPLC通过比较供试品溶液和对照品溶液的色谱图进行鉴别。（八）光谱法1.IRChp和Bp均采用红外光谱鉴别本类药物1.UV本类药物多无紫外吸收，所以较少用。

第五十四页，共63页。三、杂质检查及组分分析（一）链霉素中链霉素B的检查（甘露糖链霉素）1.来源发酵时菌种产生