免疫学检测技术基本原理

1免疫学检测技术的基本原理体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素体内：抗原+抗体→免疫反应体外：抗原+抗体→进行检测检测抗原或抗体的体外实验(血清学实验）凝集反应沉淀反应免疫标记技术蛋白质芯片技术免疫细胞功能的检测第一页，共38页。2第一节

体外抗原抗体反应的特点及影响因素（一）抗原抗体反应的特点

1.

高度特异性2.

表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）3.

适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）4.抗原抗体反应的两个阶段①抗原抗体特异性结合阶段②可见反应阶段

第二页，共38页。31.高度特异性抗原抗体反应物质基础是抗原表位(决定簇)与抗体CDR的互补结合(相互吻合，具有互补性)。第三页，共38页。4抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合。通过非共价键结合。2.表面化学基团之间的可逆结合（可逆性）第四页，共38页。5AbAgAbAg特异性结合力的表示方法亲和力和亲合力低亲合力高亲合力Ag-Ab结合的力亲和力亲合力低亲和力高亲和力第五页，共38页。63.适宜的抗原抗体浓度和比例（比例性）第六页，共38页。7（二）抗原抗体反应的影响因素1.电解质

0.85%氯化钠或各种缓冲液2.温度

37℃56℃3.酸碱度

最适pH值在6-8之间第七页，共38页。8第二节检测抗原或抗体的体外试验第八页，共38页。9定义：颗粒性抗原(细菌、细胞等或表面包被抗原的颗粒)与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块现象。一、凝集反应（agglutinationreactions)第九页，共38页。10包括：1.直接凝集反应(directagglunitationreatctions)

玻片法：ABO血型鉴定、细菌鉴定试管法：抗体效价的判定2.间接凝集反应

(indirectagglunitationreactions)第十页，共38页。11直接凝集反应1:2稀释待测血清1:41:81:16玻片法试管法ABO血型鉴定或菌种鉴定检测抗体的滴度或效价第十一页，共38页。12将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫做间接凝集反应。间接凝集反应第十二页，共38页。13二、沉淀反应（precipitationreactions）定义：可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。第十三页，共38页。14可在液体/半固体琼脂中进行。包括：1.单向琼脂扩散（可溶性抗原定量）2.双向琼脂扩散3.免疫电泳第十四页，共38页。15AgAgAgAgAbingel单向琼脂扩散用于确定抗原浓度第十五页，共38页。16Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同，抗原纯度鉴定第十六页，共38页。17免疫电泳存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。第十七页，共38页。18

将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已知的抗体或抗原标记上失踪物质，通过检测标记物，间接测定抗原-抗体复合物的一类试验方法。

三、免疫标记技术(immunolabelingtechniques)第十八页，共38页。19常用的标记物：

酶

荧光素

放射性元素

胶体金

化学发光物质等第十九页，共38页。20①免疫酶测定法双抗体夹心法ELISA间接ELISAa）b）BAS—ELISA

利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁第二十页，共38页。21d）免疫组化技术定位、定性、定量检测第二十一页，共38页。22②免疫荧光技术第二十二页，共38页。23第二十三页，共38页。24③放射免疫测定

用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。④化学发光免疫技术

将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。第二十四页，共38页。25⑤免疫胶体金技术用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。第二十五页，共38页。26⑥免疫印迹法-Westernblotting第二十六页，共38页。27四、蛋白质芯片技术又称为蛋白质微阵列，指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。根据蛋白质分子间特异性结合的原理，可实现快速、准确、高通量的检测。第二十七页，共38页。28第三节免疫细胞功能的检测淋巴细胞及其亚群的分离免疫细胞功能测定磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽-MHC四聚体技术T细胞功能测定B细胞功能测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法第二十八页，共38页。29一、免疫细胞的分离外周血单个核细胞的分离稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺)离心第二十九页，共38页。30E花环形成试验第三十页，共38页。31磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽—MHC四聚体技术淋巴细胞及其亚群的分离第三十一页，共38页。32免疫吸附分离法加入淋巴细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清第三十二页，共38页。33磁珠分离法第三十三页，共38页。34流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液5000-10000个/秒细胞分选器荧光检测器第三十四页，共38页。35二、免疫细胞功能的测定T细胞功能测定B细胞功能测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法第三十五页，共38页。36T细胞功能测定T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测：形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁；3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染、免疫缺陷病、肿瘤患者免疫功能测定。第三十六页，共38页。37B细胞功能测定抗体含量测定溶血空斑试验可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。绵羊红细胞(SRBC)免疫动物4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞脾