生物化学课件03-酶的结构与功能

第三章酶的结构与功能1第一节酶学概论2两千多年前，我国已有酿酒记载。1850年间，法国的巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1878年，Kuhne首次使用“enzyme”一词描述酵母中具有发酵作用的物质。1894年，EmilFischer证明了酶的专一性，酶与底物之间作用的锁匙关系。1897年，Buchner两兄弟用不含细胞的酵母提取物，成功地将蔗糖发酵成醇，证明发酵不需要完整的细胞。3一、酶的研究简史（自学）1913年，LeonorMichaelis和MaudMenten推导出酶反应的动力学方程式。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出尿酶结晶，揭开了酶的化学本质是蛋白质。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶（ribozyme）的概念。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称为脱氧核酶（deoxyribozyme）。

4二、酶的化学本质和组成5酶定义催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。根据酶分子化学组成可分为：单纯酶：只含有蛋白质结合酶6生物催化剂酶核酶（具有催化作用的核酸）结合酶酶蛋白作用：辅酶或辅基的作用：

起传递电子、原子和某些基团的作用即决定反应的类型决定催化反应的特异性辅助因子金属离子作用：1.活性中心的组成成分；2.连接酶与底物的桥梁；3.维持酶的构象7根据辅助因子与酶蛋白结合的牢固程度不同，又分为辅基（prostheticgroup）或辅酶（coenzyme）。辅基与蛋白质结合牢固，不能用透析、超滤等简单的物理化学方法使之分开。辅酶与酶蛋白以非共价键结合，可用上述方法使之与酶蛋白分离。89金属离子是最常见的辅助因子。金属离子的作用维持酶分子的活性构象：金属离子与酶蛋白结合成活性构象才起催化作用。传递电子：通过金属离子的电子得失而传递电子，如各种细胞色素中的Fe2+、Cu2+。在酶与作用物之间起桥梁作用：将酶与作用物联系起来，如各种激酶依赖Mg2+与ATP结合。利用离子的电荷影响酶的活性：中和电荷，降低反应中静电排斥作用等。10小分子有机化合物（铁卟啉、B族维生素衍生物NAD+、FAD等）是一些化学稳定的小分子物质，称为辅酶。其主要作用是参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。辅酶的种类不多，且分子结构中常含有维生素或维生素类物质。11根据酶分子结构的特点可分为：单体酶：只有一条多肽链的酶，仅具有三级结构。如：溶菌酶，核糖核酸酶。寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。如：糖原磷酸化酶a，己糖激酶。多酶复合体：由几个酶嵌合形成的复合体，有利于提高酶催化效率，便于对酶进行调控，分子量大，几百万以上。如：丙酮酸脱氢酶复合体，脂肪酸合酶复合体。1213酶各部分的作用不同酶催化反应的专一性决定于酶蛋白；辅助因子对电子、原子或某些化学基团起传递作用。14三、酶的催化特性1、高效性酶的催化效率通常比非催化反应高108-1020倍，比一般催化剂高107-1013倍。2、专一性绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性（1）锁钥模型（2）诱导契合模型3、反应条件温和4、酶活性的可调控性1、酶的习惯命名绝大多数酶根据所催化的底物命名，如：脂肪酶、蔗糖酶。有些酶根据所催化的反应类型或方式命名，如：转氨酶、脱氢酶。有时还加上酶的来源或其他特点，如：胃蛋白酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶。15四、酶的命名和分类2、酶的国际系统分类法和编号氧化还原酶类（oxidoreductases）转移酶类（transferases）水解酶类（Hydrolases）裂解酶类（Lyases）异构酶类（isomerases）连接酶类（ligases）根据酶促反应类型，分为六大类：16（1）氧化还原酶:催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。1)氧化酶类:催化底物脱氢,生成H2O或H2O2

A·2H+O2A+H2OA·2H+O2A+H2O22)脱氢酶类:催化直接从底物上脱氢的反应

A·2H+BA+B·2H17乳酸丙酮酸18(2)转移酶:转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。A·X+BA+BX例如，谷丙转氨酶19(3)水解酶:

催化底物的加水分解反应。包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。A·B+HOHAOH+BH20(4)裂解酶:

从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。A·BA+B21(5)异构酶:催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶。AB22(6)连接酶:催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应，这类反应与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATPA·B+ADP+PiA+B+ATPA·B+AMP+Pi例如，丙酮酸羧化酶23编号系统名称习惯名称反应1氧化还原酶（类名）1.1作用于供体的CHOH（亚类名）1.1.1以NAD+

或NADP+

为受体1.1.1.1醇:NAD+

氧化还原酶醇脱氢酶醇+NAD+

醛或酮＋NADH酶的系统命名24编号系统名称习惯名称反应2转移酶2.7磷酸基转移酶2.7.1以羟基为受体的磷酸转移酶2.7.1.1D-葡萄糖为磷酸基受体的磷酸转移酶己糖激酶ATP+D-葡萄糖→

ADP＋D-葡萄糖-6磷酸酶的系统命名（ATP:葡萄糖磷酸转移酶）25第二节酶动力学261、酶促反应速率的测量酶促反应速率：单位时间内底物浓度的减少或产物浓度的增加。反应速率在最初的时间内保持恒定，随着酶促反应时间的延长，反应速率不断下降。酶促反应速率以反应初速率为准。27一、酶促反应速率与酶活力28[P]t酶促反应过程曲线2、酶的活力单位酶活力：酶所具有的催化能力。酶活力单位(U)：在一定条件下，单位时间内转化单位底物所需的酶量。1961年，国际酶学委员会规定：酶活力国际单位（IU）：在特定条件下（25℃，最适pH和最适底物浓度等），为在1分钟内能催化1.0微摩尔的底物转变为产物的酶量（μmol/分）。291972年，国际酶学委员会又推荐一新的酶活力国际单位（kat）1个催量单位（kat）：在最适条件下，1秒钟内催化1.0摩尔（mol）底物转变为产物所需的酶量（mol/秒）。1Kat=6×107IU3、比活力比活力：每毫克蛋白质（或每克或每毫升酶制剂）所含的酶活力单位数，表示酶的纯度。3031二、底物浓度对酶促反应速率的影响1、底物浓度和酶促反应速率的关系底物浓度[S]低时，酶促反应速率（v）与[S]成正比，为一级反应；[S]↑，混合级反应；[S]增加到一定程度，酶反应速率几乎不变（最大反应速率），零级反应底物浓度对反应速率的影响呈双曲线关系。322、酶反应动力学方程――米氏方程式1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程33E+Sk1k2k3ESE+Pk4单底物、单产物反应。（1）快速平衡假说①反应初始阶段，［S］＞＞［E］，［S］的变化可忽略不计；②游离的酶与底物形成ES的速率极快，而ES形成产物（P）的速率极慢，ES分解成产物P对[ES]浓度的动态平衡没有影响，不予考虑；③反应初始阶段，[P]很小，E+P→ES的逆反应可忽略不计。34E+Sk1k2k3ESE+Pk4（2）Briggs和Haldane提出的“稳态平衡”假说①

[ES]的生成与分解处于动态平衡（稳态）②有时考虑[ES]分解成产物P对于[ES]的动态平衡的影响。[ES]分解速率不仅与ES分解成E+S有关，还与ES生成E+P有关。35E+Sk1k2k3ESE+Pk4米氏方程的推导

36E+Sk1k2k3ESE+Pk4

37米氏方程的推导

38米氏方程的推导3、米氏方程讨论

39E+S

k1k2k3ESE+Pk4当v=Vmax/2时Km＝[S]Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2（2）米氏常数（Km）的意义40

Km可近似表示酶对底物的亲和力；（Km越小，代表E与S亲和力越大）当k3

很小时，Km≈Ks＝

Kmk2+k3k141E+S

k1k2k3ESE+Pk442Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、底物和反应环境（如，温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关;同一酶对不同的底物有不同的Km值，其中Km

值最小的是酶的天然底物（最适底物）。43(3)Kcat与Kcat/Km催化常数（Kcat）或转换数（TN）：是指酶被饱和时，每秒钟每个酶分子（活性部位）转换底物的分子数。Kcat可用来衡量酶的催化效率。Kcat/Km：衡量酶的催化效率和酶的完美程度。

E+S

k1k2k3ESE+Pk4kcat=k3444、Ｋm和Ｖmax的求解方法

双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法（林－贝氏方程）两边同取倒数45

双倒数作图法以1/Vo对1/[S]作图是一条直线，1/Vo轴上的截距是1/Vmax；1/[S]轴是-1/Km；斜率是Km/Vmax。46三、pH对酶促反应速度的影响pH通过改变酶和底物分子的解离状态影响反应速率。酶催化活性最高时反应体系的pH称为酶促反应的最适pH（optimumpH）。最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度、以及酶纯度等因素的影响。47

pH对反应速度的影响胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶0酶活性pH24681048四、温度对酶促反应速度的影响酶促反应速度最快时反应体系的温度称为酶促反应的最适温度（optimumtemperature）。酶的最适温度不是酶的特征性常数，它与反应进行的时间有关。温度对酶促反应速度的影响具有双重性：从低温开始，逐渐增加温度，酶反应速度也随之增加；但到达最适温度后，继续增加温度，反应速度反而下降。升高温度，一方面可加速酶促反应的进行，另一方面会加速酶变性而减少有活性酶的数量。49温度对反应速度的影响酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC50激活剂：凡能提高酶活性的物质。激活剂51五、激活剂对酶促反应速度的影响无机离子：Na+，Mg2+,Ca2+等辅助因子：NAD+，FADH2等六、抑制剂对酶促反应速度的影响凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。酶的抑制剂可逆地或不可逆地降低酶促反应速率。抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性

酶的抑制剂（inhibitor）

酶的抑制剂不同于酶的变性521、不可逆抑制概念：抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，不能用透析、超滤等物理方法将其除去。（1）基团特异性抑制

可以和酶的一类或几类基团反应53E+I→EI二异丙基氟磷酸（DIPF）、碘代乙胺、磷酸溴代羟基丙酮的抑制机制54（2）底物类似物抑制剂例：N-对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）与胰凝乳蛋白酶的最佳底物N-对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构类似，TPCK与酶形成Ks很小的非共价络合物。TPCK对胰凝乳蛋白酶活性中心的亲和标记55（3）自杀型抑制剂这类抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中存在潜在反应基团，该基团被酶催化，然后与酶活性中心某基团进行不可逆结合，导致酶失活。此种抑制剂专一性强，又是经酶催化引起的，故称为“自杀性底物”。5657N，N-二甲基炔丙胺对单胺氧化酶生物自杀抑制2、可逆抑制作用概念：抑制剂与酶非共价结合，可用透析、超滤等方法除去。类型：竞争性抑制作用非竞争性抑制作用反竞争性抑制作用E+IEI58定义：有些抑制剂与底物结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶-底物复合物的形成，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。（1）竞争性抑制作用及其动力学59琥珀酸延胡索酸琥珀酸脱氢酶丙二酸是琥珀酸脱氢酶的强竞争性抑制剂，能阻断整个三羧酸循环。举例60I：磺胺药S：对氨基苯甲酸（PABA）磺胺药与PABA相互竞争与FH2合成酶结合磺胺类药物的抑菌机制——与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶61

竞争性抑制剂作用特点：I与S结构类似，互相竞争与酶结合；抑制程度取决于[S]和[I]的相对比例；↑[S]，可以减少或去除抑制作用；Vmax不变，Km增大。6263取方程的倒数，进行双倒数作图64（2）反竞争性抑制作用

概念：抑制剂仅与酶-底物复合物（ES）结合，使酶失去催化活性。反竞争抑制（与酶活性部位以外的部位结合，且只与ES复合物结合）65反竞争性抑制剂作用特点：抑制剂只与酶-底物复合物结合；抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度；Vmax降低，Km降低。66与米氏方程比较双倒数作图67（3）非竞争性抑制作用及其动力学

概念：抑制剂和底物结构不相似，两者互不干扰同时与酶结合，从而抑制酶活性。68

非竞争性抑制剂作用特点：I与S结构不相似；

I与S互不干扰同时与酶结合；抑制程度只取决于[I]抑制剂的浓度；↑[S]，不能去除抑制作用

Vmax降低，Km不变。6970双倒数作图7172第三节酶的催化机制73必需基团：酶分子中与酶活性相关的基团（羟基、巯基、咪唑基和羧基）活性中心内必需基团——结合和催化活性中心外必需基团——维持酶构象活性中心：酶分子与底物结合并将底物转化为产物的空间结构区域。结合基团：与底物结合，形成酶底物复合物催化基团：把底物转化为产物酶的活性中心74底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心7576一、“过渡态稳定”学说底物到产物要经历一种不稳定的构型，称为过渡态。它是反应过程中一种极不稳定的状态，而不是能够鉴定或分离出的一个独立分子，具有最高自由能。基态和过渡态之间的能量差异称为活化能（ΔG‡）。催化剂可以降低反应的活化能，从而提高反应速率。据计算，在25℃时，活化能每减少4.184kJ/mol（1kcal/mol），反应速度可增加5.4倍。7778

酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能酶促反应中共价键的重组：酶的催化功能基团或与底物形成一个短暂的共价键，使底物活化而发生反应；或者底物上的某个基团被暂时地转移到酶的基团上。酶与底物的非共价相互作用：用来降低反应活化能的大量能量来自于酶和底物之间弱的非共价的相互作用。（酶的大多数催化力来自于酶与底物形成多个弱键和相互作用时释放的自由能。）79“铁丝酶”催化反应的过渡态稳定机制（a）在断裂之前，要先弯曲（过渡态）。用磁力代表酶和底物间的弱的相互作用。80（b）酶有一个磁性的口袋，其结构与底物互补，用来稳定底物，金属棒与酶之间的磁力吸引使其嵌入结合。如果酶同底物互补，ES复合物就更稳定，其自由能比底物自身的基态还低，从而导致活化能的升高。81（c）酶与反应过渡态互补使底物失去稳定性，从而催化裂解反应。磁性相互作用的结合能抵消弯曲金属棒所需升高的自由能。821、邻近效应及定向效应邻近效应：指两个反应的分子（酶与底物），它们反应的基团需要互相靠近，才能反应。邻近效应把底物束缚于酶的表面,防止由基态转变为过渡态时熵值猛烈下降,从而降低了反应活化能,加快反应速度。定向效应:指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取向。底物与酶结合时，其受催化攻击的部位定向对准酶活性中心（定向排列），进一步提高催化效率。83二、酶稳定过渡态的化学机制84Reactionsofanesterwithacarboxylate(羧盐)grouptoformananhydride(酐)2、底物分子敏感键扭曲变形底物与酶活性中心结合时，使底物分子敏感键扭曲变形，促进中间产物ES进入过渡态，降低活化能，加速酶促反应。853、广义酸碱催化广义的酸(碱)催化:

反应能被其他的质子供体或受体催化,而不是单独被H3O+催化。广义酸碱催化在生理pH时变得重要。一些酶的活性中心含有氨基酸功能基团,在催化过程中充当质子供体或受体――（广义酸碱催化）。广义酸碱催化能提高反应速度102–105。86广义酸碱催化的氨基酸874、静电催化通过酶活性中心的带电基团对带有相反电荷的过渡态的中和而稳定过渡态。例：溶菌酶活性中心有一个带负电荷的Asp，可以中和带正电荷的过渡态。885、共价催化某些酶可以与底物形成短暂的共价键，使底物活化从而进一步反应，这种催化类型叫共价催化。共价催化分为亲核催化和亲电催化。酶活性中心可提供非共用电子对的基团主要包括:Ser/Thr上的羟基氧、Asp/Glu侧链羧基带负电荷的氧、Cys巯基硫、去质子化的咪唑基氮等,构成负电中心(或亲核剂),攻击底物分子中的缺电子中心(δ+)，形成不稳定的共价中间产物,称为亲核催化。89

酶活性中心的羰基、质子化的氨基、质子化的羧基、质子化的咪唑基、金属离子、磷酸吡哆醛等，构成缺电子中心（或亲电子剂,electrophile）,攻击底物分子中的负电中心(δ-)，形成不稳定的共价复合物，称为亲电催化