第八章发酵过程的放大

（优选）第八章发酵过程的放大当前1页，总共129页。“发酵放大是一门艺术，而不是一门科学”

——A.E.Humphrey当前2页，总共129页。

就目前为止，生化放大过程一直是一个难题。

虽然很难用理论分析，但是并不是放大问题没解决就不能放大，反应器的不足可以通过工艺及控制手段来弥补，工艺的欠缺也可以通过改善反应器型式来修正。当前3页，总共129页。主要内容一、从摇瓶取得发酵罐放大有用参数的方法及原理二、以摇瓶取得数据为依据进行发酵过程和发酵罐放大三、小型罐到大型罐的放大当前4页，总共129页。工业发酵过程的放大第一阶段实验室规模，进行菌种的筛选和培养基的研究当前5页，总共129页。第二阶段中试工厂规模，确定菌种培养的最佳操作条件当前6页，总共129页。当前7页，总共129页。当前8页，总共129页。当前9页，总共129页。当前10页，总共129页。当前11页，总共129页。当前12页，总共129页。当前13页，总共129页。第三阶段工厂大规模生产当前14页，总共129页。第一节、从摇瓶取得发酵罐放大有用参数的方法及原理摇瓶培养是在菌种的筛选培养阶段（中试），中试生产的目的是确定菌种培养的最佳操作条件以便于转移到大规模发酵罐进行生产当前15页，总共129页。在锥形瓶中装入一定量的培养基，经灭菌后接种，在摇床上恒温振荡培养；在培养过程中分析测定培养液中的有关参数和产物得率。当前16页，总共129页。摇瓶试验结果提供了生产菌株的基本信息和发酵工艺数据，经过中试放大后用于工业化生产。但是摇瓶和发酵罐培养之间的差异是不可避免的，其本质原因是由这两种试验规模变化所引起的。当前17页，总共129页。摇瓶和发酵罐培养的差异体积传氧系数（KLa）和溶氧的差异CO2浓度的差异菌丝受机械损伤的差异当前18页，总共129页。体积传氧系数（KLa）和溶氧的差异

通气状况摇瓶培养：空气透过纱布（瓶塞），纱布（瓶塞）对氧传递的阻力、表明通气情况与周围环境有关发酵罐：直接通入空气，鼓泡通气；KLa值

溶氧系数在摇瓶和发酵罐中差异很大当前19页，总共129页。摇瓶的KLa值装料系数（mL）KLa×107往复式旋转式1017.9211.492015.426.875011.042.961006.511.96往复式：250mL摇瓶，冲程127mm，96次/min;旋转式：250mL摇瓶，偏心距50mm，215rpm当前20页，总共129页。发酵罐的KLa值搅拌转速（rpm）四种Vs时KLa值5.62×10-77.04×10-78.79×10-710.55×10-725217.621.92529.232024.227.237.742.238030.867.541.943.5Vs为发酵罐中空气分布器出口的空气线速度(m/s)当前21页，总共129页。2.CO2浓度的差异CO2是微生物的代谢产物多数微生物适应低CO2浓度（0.02~0.04%）。当排除的CO2浓度高于4%时，碳水化合物的代谢及呼吸速度下降，影响菌体生长、形态及产物合成当前22页，总共129页。摇瓶——常压状态；发酵——正压状态在这两种发酵形式中CO2在发酵液中的溶解度不同（发酵罐内的浓度显著高于摇瓶内的浓度）当前23页，总共129页。3.菌丝受机械损伤的差异摇瓶培养：菌体只受液体的冲击或沿着瓶壁滑动影响——机械损伤很轻；发酵罐培养：受搅拌叶的剪切力、搅拌时间的长短等——机械损伤程度远远大于摇瓶培养。当前24页，总共129页。搅拌增加菌体受损伤的程度菌体内核酸类物质的漏出率与搅拌转速、搅拌持续时间、搅拌叶的叶尖线速度、培养液单位体积吸收的功率及Kla值成正比关系虽然摇瓶发酵液有少量的核算类物质漏出，其漏出率远低于发酵罐。当前25页，总共129页。摇瓶放大培养的结果溶氧敏感，罐中生产能力可能高于摇瓶；机械损伤敏感，罐中的生产能力低于摇瓶；溶氧和机械损伤都敏感，其结果随发酵罐中的特性而定当前26页，总共129页。如何从摇瓶发酵获得参数用于发酵罐试验1.增加摇床的转速，提高KLa和溶氧水平2.减少培养基的装液量，注意水分蒸发引起的误差3.直接向摇瓶中通入无菌空气或氧气等措施4.在摇瓶中加入玻璃珠来模拟发酵罐中搅拌，从而研究因搅拌引起的差异5.在摇瓶中附加挡板也可模拟罐发酵时菌丝体的损伤当前27页，总共129页。第二节以摇瓶取得数据为依据进行发酵过程和发酵罐放大发酵罐的类型很多，所适用的体系也各异，因此发酵罐的放大是比较复杂的。发酵的放大可以依据一些放大准则当前28页，总共129页。好氧发酵中，从摇瓶到中试罐发酵，一般采用以KLa为基准的比拟放大当前29页，总共129页。以kLa为基准的比拟放大法有的菌种在深层发酵时耗氧速率很快，因此溶氧速率能否与之平衡就可能成为生产的限制性因素。耗氧速率可以用实验法测定。在小型试验发酵罐里进行发酵过程，用适当的仪器记录发酵液中的溶氧浓度。KLa－－氧传递系数是什么？当前30页，总共129页。取样极谱法当电解电压为0.6～1.0V时，扩散电流的大小随液体中溶解氧的浓度成正比变化。当前31页，总共129页。KLa,KLa’－－容量传质系数，h-1Patm—大气中氧的分压，PaPflask――摇瓶内氧的分压，Pa；A－摇瓶口截面积，cm2VL’－－培养液体积，mlVL――对应时刻培养液真实体积，mlOUR=PmA(patm-pflask)/VL;OUR’=PmA(pa-pf)/VL’KLa=OUR/(C*flask-CL)；KLa’=OUR/(c*-cL)Pm－－摇瓶口过滤层氧通透率，mmol/(cm2·h·Pa)OUR,OUR’－－培养液中菌体的摄氧率，mmol/(L·h)一、实际发酵情况下摇瓶内KLa的测定当前32页，总共129页。当前33页，总共129页。二、溶氧和其他因素对发酵的影响通过调节摇瓶装液量或摇床转速来确定溶氧对发酵的影响，并获得最佳的溶氧条件(KLa值）；建立动力学模型

μ=μmaxS/(S+Ks)OUR=-μx/Yx/O2当前34页，总共129页。pH对发酵的影响cNa+=cNaOH

cK+=cK2HPO4

+cKH2PO4dcSO42-/dt=D(cSO42-F-cSO42-)+ABtSO42-不同的剪切力对发酵的影响

摇瓶中添加玻璃珠数量对菌体浓度和产物得率的影响当前35页，总共129页。动力学模型的实验验证当前36页，总共129页。一、发酵罐的放大原则

（1）几何相似即按小的与大的装置各部分几何尺寸比例大致相同放大。但是，为了避免设备直径过大，大设备的高径比往往大一些。（2）恒定等体积功率放大由Pg/V恒定而确定搅拌转速。（Pg指通气时的搅拌功率）第三节小型罐到大型罐的放大

当前37页，总共129页。体积（V）罐内径D/mm罐体总高H/mm高径比H/D50L3208502.66200L50013002.6500L70018002.571m390023002.5610m3180045802.5475m3320098303.07200m34600139003.02H/D=1.7~3.5常用机械搅拌通风发酵罐的系列体积及尺寸当前38页，总共129页。（3）恒定传氧系数kLa放大这个方法抓住了传氧这一关键因素，目前应用很多。具体应用中要注意几个问题。

1.小试中要测得准确的kLa值，选择合适的计算公式。

2.注意各计算kLa公式在放大中参数的变化及适用范围。

3.按照计算P0/Pg选择通气比，计算V求kLa来计算（P0指不通气时的搅拌功率）当前39页，总共129页。（4）恒定剪切力恒定叶端速度放大剪切力与搅拌桨叶端速度成正比，在恒定体积功率放大时一般维持n3d2不变（n为搅拌桨转速、d为搅拌桨直径，一般搅拌叶轮直径与罐直径之比为0.33~0.45）（5）恒定的混合时间tM放大

当前40页，总共129页。（一）以kLa为基准的比拟放大法（二）以Po/V相等为准则的比拟放大（三）其他的比拟放大方法当前41页，总共129页。

例：某厂试验车间用枯草杆菌在100升罐中进行生产。—淀粉酶试验，获得良好成绩。放大至20立方米罐。当前42页，总共129页。以KLa为基准的比拟放大当前43页，总共129页。P0——不通气时的搅拌功率当前44页，总共129页。Pg——通气时的搅拌功率当前45页，总共129页。当前46页，总共129页。H－罐身高m；HL－不通气时的液位高m；T－罐直径m；D－涡轮搅拌器直径，m；当前47页，总共129页。当前48页，总共129页。当前49页，总共129页。当前50页，总共129页。当前51页，总共129页。当前52页，总共129页。以Po/V相等为准则的比拟放大对于溶氧速率控制的非牛顿发酵液系统，把Po/V相等作为比拟放大的准则就非常方便，同时也避免了微生物参与所带来的计算kLa的困难。值得注意的是，Po/V与传质系数之间的确存在着重要的关系，但Po/V相等并不意味着kLa相等。二者之间没有必然的联系。流体单位面积上所承受的剪切应力τ,与单元的剪切速率dy/du成正比,称为牛顿粘性定律,服从这一定律的流体称为牛顿型流体.

当前53页，总共129页。当前54页，总共129页。其他的比拟放大方法（一）恒周线速度

丝状菌发酵受剪率、特别是搅拌叶轮尖端线速度的影响较为明显。如果仅仅保持kLa相等或Po/V相等，可能会导致严重的失误。在Po/V相等的条件下，D/T比越小，造成的剪率越大，也有利于菌丝团的破碎和气泡的分散，这对于产物抑制的发酵有重要意义。所以，对于这类发酵体系，搅拌涡轮周线速度也被认为是比拟放大的基准之一。当前55页，总共129页。其他的比拟放大方法（二）恒混合时间

混合时间的定义是把少许具有与搅拌罐内的液体相同物性的液体注入搅拌罐内，两者达到分子水平的均匀混合所需要的时间。混合时间主要与发酵液的粘度有关，通常，低粘度的液体混合时间要少于高粘度的液体。另外，放大罐的体积越大，混合时间就越长。当前56页，总共129页。目前，比拟放大虽然必须以理性知识为基础，但也离不开丰富的实际运转经验，特别是对于非牛顿流体发酵系统尤其如此。

当前57页，总共129页。发酵液的流变学和CFD模拟———发酵过程优化放大研究进展当前58页，总共129页。

反应液的流变学特性：是指液体在外加剪切力作用下所产生的流变特性，简称流变特性

。

当给定的流体在外加剪切力的作用下，一定产生相应的剪切速率（即速度梯度或切变率，N/m2或Pa），两者之间的关系为该流体在给定温度和压力下的流变特性：

1.流体的流变学特性

上式称为流变性方程，其图解形式叫做流变图。生物反应醪液多属与时间无关的粘性流体范围（表5-1）。当前59页，总共129页。表5-1与时间无关的纯粘性流体的流变特性

类别流变性方程表观粘度a示例牛顿型假塑型(幂律)膨胀型(幂律)平汉塑型凯松塑型恒定不变随剪切率的增加而减少随剪切率的增加而增加气体、水、低分子量液体,低分子化合物的水溶液大多数发酵醪，淀粉悬浮液，纸浆，油漆玉米粉和糖溶液，淀粉，流沙等纸浆，牙膏，油，巧克力及一些发酵液等血，蕃茄酱，桔子汁及一些发酵液等

0为屈服应力Pa，Kp为刚性系数Pa·s，K’p为凯松粘度(Pa·s)1/2。当前60页，总共129页。

有多种经验方程来描述非牛顿流体的流变特性，其中最简单的形式是指数律方程。式中：K——稠密度指数，或称指数律系数Pa·s；

n——流变性指数，或称指数律的方次。对于牛顿型流体，n=1，K=。对于非牛顿型流体，将/定名为表观粘度。给定流体的表观粘度是剪切速率的函数。Ʈ=KƔn当前61页，总共129页。发酵液流变学特性为菌体的大小和形状的不同所影响一些稀薄的细菌发酵液；以水解糖或糖蜜为原料培养酵母的醪液；为噬菌体侵害的发酵液等均为牛顿流体。丝状菌悬浮液菌呈丝状或团状。丝状菌的菌丝一般有一个以上的分枝，这些菌丝长约50-500m，直径为9～10m。反应器中，这些菌丝体纠缠在一起，使悬浮液粘度达数Pas。团状菌丝体是以稳定的球状积聚在一起而生长，其直径可达几mm。无论是丝状或团状，流变学特性都是非牛顿型流体。2.发酵液的流变学特性当前62页，总共129页。表5-2发酵液的流变特性产物微生物发酵液流变特性制霉菌素青霉素青霉素青霉素链霉素新生霉素卡那霉素曲古霉素曲古霉素非洛霉素诺尔斯氏链霉菌产黄青霉菌产黄青霉菌产黄青霉菌灰色链霉菌雪白链霉菌卡那霉素菌卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌卡那霉素链霉菌牛顿性流体假塑性流体塑性流体胀塑性流体塑性流体塑性流体假塑性流体塑性流体假塑性流体假塑性流体当前63页，总共129页。

丝状菌发酵中，高粘度发酵液的表观粘度明显随剪切速率的不同而变化。同一反应器中，离搅拌器远近位置的不同，流动特性明显不同。一般丝状菌的发酵液呈假塑性流体、胀塑性流体等非牛顿性流体特性，并且发酵液的流动特性还随时间而变化。微小颗粒悬浮液的粘度是多种因素的函数，除依赖菌体颗粒的浓度外，还受颗粒的形状、大小、颗粒的变形度、表面特性等因素影响。霉菌或放线菌等的发酵中，发酵液的流动特性常出现大幅度变化。当前64页，总共129页。丝状菌发酵中，菌体相互间易形成网状结构，在一定的剪切速率下，团状结构的菌团可被打碎成小片，虽然这些小碎片可再聚集起来，但在高剪切速率下，絮集起来的菌团又将被打碎，使发酵液呈牛顿型流体特性。

总之，流体特性因素都会对生化反应器内的质量与热量的传递、混合特性及菌体生长等产生影响。当前65页，总共129页。3.计算流体力学（ComputationalFluidDynamics）在发酵过程中的应用当前66页，总共129页。数值解与解析解对于科学与工程问题往往需要数学建模，再对方程求解。在解组件特性相关的方程式时，大多数的时候都要去解偏微分或积分式，才能求得其正确的解。依照求解方法的不同，可以分成以下两类：解析解和数值解。当前67页，总共129页。数值解(numericalsolution)是采用某种数值方法，如有限元的方法,数值逼近,插值的方法,得到的解。只能利用数值计算的结果,而不能得到自变量和应变量的函数关系，而求出任意给定自变量的应变量的值。当无法藉由微积分技巧求得解析解时，这时便只能利用数值分析的方式来求得其数值解了解析解(analyticalsolution)就是一些严格的公式，给出任意的自变量就可以求出其因变量，也就是问题的解，他人可以利用这些公式计算各自的问题当前68页，总共129页。流体力学中数值方法的应用流体力学，是研究流体(液体和气体)的力学运动规律及其应用的学科。主要研究在各种力的作用下，流体本身的状态，以及流体和固体壁面、流体和流体间、流体与其他运动形态之间的相互作用的力学分支。理论流体力学和实验流体力学两大分支。理论分析是用数学方法求出问题的定量结果。但能用这种方法求出结果的问题毕竟是少数，计算流体力学正是为弥补分析方法的不足而发展起来的。当前69页，总共129页。实验流体力学：F1中的风洞实验，来模拟赛车表面的空气动力学，但若要真实模拟往往耗资巨大理论流体力学：CFD方法来模拟赛车表面的动力学，再小范围的实验验证当前70页，总共129页。CFD发展历史20世纪初，Richard提出用数值方法来解流体力学问题，但本身问题的复杂性和计算工具落后，未受重视1963年，美国F.H哈洛和J.E.弗罗姆用当时的IBM7090计算机，成功解决了二维长方形柱体的绕流，受到普遍重视1963至今，计算机工业的发展大力推动了CFD的发展，使得求解更快速当前71页，总共129页。CFD在生物反应器中的应用反应器中的发酵液、气体、补料等都是流体。大型反应器中物料并非均匀混合的，这会造成局部细胞生长的差异模拟生物反应器内的不同部位的流体特性，能对工程放大、设备改造及工艺优化有重要的指导意义，如气含率分布，底物浓度梯度的模拟。当前72页，总共129页。CFD数值基础把连续的流体在计算机上用离散的方式来处理把空间区域离散化成小胞腔，以形成一个立体网格或者格点，然后应用合适的算法来解运动方程（对于不粘滞流体是欧拉方程，对于粘滞的是纳维-斯托克斯方程(Navier-Stokesequations)。当前73页，总共129页。层流和湍流模型对于层流情况和，直接求解纳维-斯托克斯方程是可能的(通过直接数值模拟)。但生物过程中大部分为湍流，因此湍流模拟需要引入湍流模型。大涡流模拟和RANS表述（雷诺平均纳维－斯托克斯方程）和k-ε模型或者雷诺应力模型一起，是处理这些尺度的两种技术。当前74页，总共129页。常用于CFD模拟的软件1.AVL/FIRE

当前75页，总共129页。2.CFX当前76页，总共129页。3.Fluent当前77页，总共129页。4.Flow-3D/flow-3d/当前78页，总共129页。其他商业软件包KIVANUMECAPhoenicsSTAR-CD。当前79页，总共129页。搅拌生物反应器CFD模拟及其在发酵中的应用当前80页，总共129页。反应器●大气流场变化●气候的更迭发芽开花结果落叶迁徙变色冬眠……●罐内流场变化●混合的差异●浓度梯度●剪切差异自然界形态代谢转录……流场差异生理响应自然界与反应器的流场当前81页，总共129页。反应器内流场研究的需要流场影响着生理特性反应器设计的需要工业发酵设备改造与优化生物过程放大与优化当前82页，总共129页。生理特性温度梯度对代谢的影响浓度梯度对代谢的影响溶氧水平对代谢的影响剪切对菌体活力的影响当前83页，总共129页。反应器设计的需要桨型选择功率配置传热性能当前84页，总共129页。工业发酵设备改造与优化现有设备存在的不足改进方案改进与优化后效果预测当前85页，总共129页。生物过程放大与优化不同规模反应器内流场的差异不同规模的关键敏感因素结合菌体生理特性的分析当前86页，总共129页。流场研究方法理论方法实验方法数值方法流场分析广泛应用于各行业中湍流复杂性当前87页，总共129页。CFD在搅拌反应器模拟中的应用最早研究始于20世纪70年代最初依赖于流场测定实验作桨的边界条件后来慢慢脱离实验边界条件，形成一系列描述搅拌桨的模型高精度的大涡模拟以及直接数值模拟的出现，处于研究阶段当前88页，总共129页。国内外研究进展国内研究进展北京化工大学——非牛顿流体中科院过程工程研究所——多相流理论华东理工大学天津大学（2002）南京工业大学（2003）基本上还处于研究阶段当前89页，总共129页。国内外研究进展国外研究进展发展出了应用于搅拌反应器模拟的软件模块Fluent——MixSimV2.0StarCD——MixPertCFX——PreMixus广泛应用于搅拌生物反应器的研究领域NienowA.W.——Birmingham，UKRanadeV.V.——IndiaJenneM.——Bioengineering，Germany欧洲发展最为成熟——欧洲国际搅拌会议每三年一届当前90页，总共129页。CFD模拟的主要内容计算流体力学②①第一部分：应用CFD软件研究机械搅拌式生物反应器内的流场特征第二部分：菌体生理特性与反应器内流场间的关系当前91页，总共129页。CFD模拟的流程发酵罐内流场模拟与实验研究牛顿流体非牛顿流体混合情况研究氧传递情况研究剪切环境研究菌种生理特性考察抗剪切性形态比生长速率OUR计算模拟实验考察桨型选择……某一特定菌种流体特性流场特性当前92页，总共129页。搅拌反应器混合特性的研究混合时间模拟循环时间分布混合均匀度当前93页，总共129页。搅拌反应器内剪切力的研究方法直接模拟法τ:剪切应力，单位：Paμ:黏度，单位：Pasγ:剪切应变率，单位：s-1当前94页，总共129页。搅拌反应器内气液氧传递情况模拟方法当前95页，总共129页。案例介绍搅拌生物反应器内混合过程的模拟不同桨型的剪切场大型搅拌反应器内的流场流场对生理特性的影响当前96页，总共129页。混合过程的模拟混合时间模拟循环时间模拟当前97页，总共129页。50L反应器内混合时间模拟T=H=220mmD=0.46TC=0.33TB=0.1T当前98页，总共129页。SlidingMeshMethodInterface位置的影响50L反应器内混合时间模拟（I）（II）（III）当前99页，总共129页。50L反应器内混合时间模拟第一种Interface位置当前100页，总共129页。50L反应器内混合时间模拟不同interface位置模拟的混合时间与文献值比较当前101页，总共129页。循环时间分布模拟循环时间分布的模拟ImpellerParticlesTankwallTankbottomImpellerParticles初始粒子数：2000当前102页，总共129页。循环时间分布模拟循环时间分布统计CentrifugalImpeller123Liquidsurface当前103页，总共129页。不同桨型的流场径流桨六平叶 ●半圆管六弯叶 ●MaxfloT六箭叶轴流桨六斜叶 ●四宽叶涡轮桨 ●三宽叶A310 ●A320当前104页，总共129页。与几何参数间的关系-桨型2Pa2.3-1800s-131.37s-13.3-2080s-127.27s-15-1190s-126.28s-1当前105页，总共129页。特征性分布桨叶几何参数相同10/27当前106页，总共129页。剪切力分布

-Conclusion

分布受几何参数控制搅拌桨型及安装位置通气形式大小受操作参数控制通气比搅拌转速最大剪切有特征性地分布常规操作条件下这种特征性分布不会发生变化当前107页，总共129页。60吨灰黄霉素发酵罐流场发酵液粘度：3200cp搅拌转速：135rpm通气比：1vvm当前108页，总共129页。50吨洛伐生产罐改造前后气含率分布比较发酵液粘度：900cp搅拌转速：150rpm通气比：0.8vvm当前109页，总共129页。60t林可霉素桨空转50L发酵液粘度：100cp搅拌转速：145rpm通气比：0.72vvm搅拌转速：240rpm通气比：1vvm当前110页，总共129页。120吨红霉素发酵罐改造当前111页，总共129页。改造前速度矢量图当前112页，总共129页。改造后速度矢量图当前113页，总共129页。江桥60吨灰黄霉素发酵罐

模型参数几何参数长度罐体直径(mm)3000罐体直边高(mm)7200罐体装液直边高(mm)6270通气管径(mm)150搅拌层数4搅拌形式与桨直径(mm)顶层四宽叶(1200)第二层四宽叶(1200)第二层四宽叶(1150)底层半圆管(1100)操作参数参数值发酵液粘度100h发酵液搅拌转速123rpm通气比0.7vm当前114页，总共129页。非牛顿型流体与牛顿型流体当前115页，总共129页。100小时的发酵液非牛顿性最强当前116页，总共129页。气含率的比较当前117页，总共129页。