活体生物发光和荧光成像技术应用讲座2016年,7

1仪器结构与组成第一页，共58页。2

NightOWLⅡLB983

新一代分子成像设备NightOWLⅡLB983具有强大的活体组织发光影像分析能力。无论是对BLI荧光素酶系统产生的弱光信号还是BFI荧光染料或荧光蛋白所发出的荧光影像信号，NightOWLⅡLB983都能为使用者提供可靠的清晰的检测结果并配有强大的科学分析软件对数据进行处理。第二页，共58页。3视野连续可调，自动聚焦3.5cm75

cm焦距(cm) 分辨率(µm)3.5 5075 320第三页，共58页。43种荧光激发光源配件环状照射装置鱼尾型照射装置鹅颈管照射装置

散射光滤光片90W钨灯光源200-1100nm可选滤光片荧光成像配件第四页，共58页。5气体流量计麻醉气体蒸发器诱导麻醉箱输送管道麻醉机组成第五页，共58页。6祛除宇宙射线和背景视野校准定量分析功能原始数据与处理后数据分开存档（根据GLP规则）三种图像输出模式indiGoTM–功能强大的软件伪彩图灰度图真彩图第六页，共58页。7成像原理与特点第七页，共58页。8目前的活体生物体内成像技术和方向可见光及荧光成像--生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）正电子衍射成像（Positron-EmissionTomography，PET）--放射性标记葡萄糖导入体内，被分裂旺盛组织吸收，常用于检测肿瘤的良恶性单光子衍射(Single-Photon-EmissionComputedTomography,SPECT)超声（Ultrasound）--物理学方法计算机断层摄影（ComputedTomography，CT）--断层扫瞄技术，X-ray的衍生，物理学方法核磁共振（MagneticResonanceImaging，MRI）--包括功能性核磁共振（FunctionalMRI，fMRI）,心血管核磁共振（Cardio-vascularMRI，cMRI），等等第八页，共58页。9几种常用活体体内成像技术的比较结构成像功能成像操作复杂操作简单MRI核磁共振OpticalImaging可见光成像PET/SPET正电子衍射Ultrasound超声CT第九页，共58页。10理想的光源：萤火虫荧光素酶（luciferase）基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。活体生物发光成像系统原理●遗传学标记●实时、原位●多波长检测标记癌细胞标记细菌标记转基因鼠第十页，共58页。11荧光素酶的表达

将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。启动子染色体体内表达外源注入底物活跃细胞体内发光第十一页，共58页。12标记细胞发光强度与定量分析第十二页，共58页。13

小鼠皮下总计1000个细胞或每mm²20个细胞可以很容易地被检测到，探测极限是一丛150–250个细胞.生物发光活体成像方面的灵敏度第十三页，共58页。14 在微孔细胞板中少到10个细胞可以检测到.生物发光微孔板检测的灵敏度第十四页，共58页。15如何提高灵敏度NatureMedicine2011年1月第十五页，共58页。16平均肿瘤体积平均相对光单位对数值生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关1x106，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射第十六页，共58页。17生物发光的应用第十七页，共58页。18活体成像技术的主要应用标记细胞

癌症及药物研究标记病毒,DNA,RNA

病毒学及基因治疗转基因动物模型蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学，等等…标记基因

siRNA研究的应用干细胞,免疫其它…细胞凋亡组织特异性基因表达标记细菌第十八页，共58页。19体内药物分析的生物发光检测1x106，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射14天21天28天35天雄性SCID小鼠处理方式细胞数无治疗对照2.2x1095-FU治疗2.8x108丝裂酶素3.6x106治疗小鼠#6n=7小鼠#40n=8(从第11天开始给药)小鼠#31n=8(从第11天开始给药)第十九页，共58页。20对照组于第五周结束观察生物发光强度

Exp#081雄性nu/nuCRn=13,5,7n=13n=6/7n=3/5生物发光检测体内药物治疗的复发作用5x105，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌1周3周5周7周8周生理盐水对照组（小鼠#40）静注，3次/周，第二、三周5-Fu治疗组（小鼠#38）100mg/kg静注，1次/周，第二、三、四周丝裂酶素治疗组（小鼠#4）2mg/kg静注，3次/周，第二、三周第二十页，共58页。21肺癌模型A549原位肺癌NIH2010第二十一页，共58页。22乳腺癌原位接种PNAS2010,10第二十二页，共58页。23原位胰腺癌模型2010第二十三页，共58页。24白血病模型2×105

Arf-/-p185+luc+LICs.2011年9月BLOOD第二十四页，共58页。25BCL6enablesPh1acutelymphoblasticleukaemiacellstosurviveBCR–ABL1kinaseinhibition

2011年5月NATURE45678接种后周数第二十五页，共58页。26U87脑胶质瘤成像

cancerresearch2011,8PTAofU87humangliomasinmousebrains.A,representativebioluminescenceimagesofnudemicebearingU87-TGLtumorswithdifferenttreatments(seeMaterialsandMethods).第二十六页，共58页。27骨肉瘤转移机理研究第九人民医院第二十七页，共58页。28肿瘤转移第二十八页，共58页。29乳腺癌转移实验中科院健康所2011第二十九页，共58页。30利用转基因技术自发肿瘤的研究MYCinactivationuncoverspluripotentdifferentiationandtumourdormancyinhepatocellularcancer

NATURE2004第三十页，共58页。31cancercell2004,10抗癌药物的临床前研究第三十一页，共58页。32抗体药物研究CD137stimulationenhancestheantilymphomaactivityofanti-CD20antibodies2011年10月BLOOD第三十二页，共58页。33研究干细胞造血作用Caoetal,PNAS2004PercentGFP+Cells(corrected)80706050403020100FVBN1N2N3N4N5P1P2P3P4P5P6TotalleukocytesGranulocytesBcellsTcellsDonorlinecrossedtoFVBCg-TgaGFPTgline第三十三页，共58页。34心脏内成像BMCswithgreenfluorescentprotein-FLucwereadministeredthroughthetailvein24hoursaftermyocardialinfarction.BLIdemonstratedagreaternumberofBMCshomedtotheperiinfarctregioninthedouble-knockdowngroup,withpeakhomingatday7.第三十四页，共58页。35免疫治疗研究EDINGERetal，2003，bloodTraffickingofCIKcells第三十五页，共58页。36当共转染pGL3-luc或HCV-luc表达载体特异的siRNA时，可抑制报告基因Luciferase的表达(McCaffreyetal.Nature,408,38-39,2002.CopyrightpermissionfromNaturepublishinggroup)抑制荧光素酶(pGL3-control)抑制丙型肝炎病毒(pShh1-Ff1)第三十六页，共58页。37外源质粒在体内表达

中国军事医学科学院

2010质粒pGL3-LUC质粒，通过水动力方法注入小鼠体内后，在肝脏中与luciferase反应后大量表达

第三十七页，共58页。38实验性心内膜炎症的抗生素筛选大鼠模型对照组vancomycin

vancomycincefazolin

gentamicin

第三十八页，共58页。39

细菌的感染模式研究MembranousCellsinNasal-AssociatedLymphoidTissuetheRespiratoryMucosalPathogenGroupAStreptococcus1

第三十九页，共58页。40基因治疗载体的构建AdTSTA-FL的表达活性比AdCMV-FL高100倍以上AdTSTA-FL（107）AdCMV-FL（107）Days571013800600400200500400300200100×103×105第四十页，共58页。41AgeneticallyhumanizedmousemodelforhepatitisCvirusinfectionNATURE2011年6月第四十一页，共58页。42体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用LUCN端与C端分开时并不发光蛋白质A与蛋白质B分别与LUCN端和C端连接两组蛋白由不同的质粒诱导表达蛋白A蛋白BLucN端LucC端蛋白A蛋白BLuciferase发光相互作用+第四十二页，共58页。43活体动物体内观察细胞凋亡LUCIILUCIILaxman,etalPNASV.99CaspasesiteCaspasesite发光ApoptosisCaspase表达第四十三页，共58页。44活体动物细胞及组织特异性基因表达构建双重标记的细胞株(RENILLA&FIREFLYLUCIFERASE),识别不同底物的发光酶研究基因的启动子控制FIREFLYLUCIFERASE表达,与兴趣基因平行表达.RENILLALUCIFERASE作为内参,标记细胞数量

RENILLALucFIREFLYLucPcRenLucFirLucP53发光发光第四十四页，共58页。45荧光和量子点标记的应用第四十五页，共58页。464H9在荷瘤小鼠中的分布(U87V3)

50µgcy5.5labeled4H9,i.v.2hr6hr24hr仰卧右侧卧第四十六页，共58页。47GFP标记的肺癌皮下模型NightOWLⅡLB983上海肿瘤研究所2007年第1周第2周第3周第4周第四十七页，共58页。48药物的肿瘤靶向性研究复旦药学院2007年11月荧光染料标记药物载体，识别未标记的肿瘤第四十八页，共58页。49荧光染料（Cy5.5)标记的探针对肿瘤细胞的识别NightOWLⅡLB983上海肿瘤研究所2007年第四十九页，共58页。50量子点标记成像注射部位：右侧前爪皮下注射；量子点聚集区域：腋下淋巴结，利用gooseneckspotillumination作为激发光源，光能40%

第五十页，共58页。51转基因动物的应用第五十一页，共58页。52基因激活表达生物发光研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断靶基因是否表达，既基因的“开”“关”现象。转基因动物模型原理生物大分子合成第五十二页，共58页。53血管内皮细胞生长因子受体2（Vascularendothelialcellgrowthfactorreceptor2,V