实验九DNA的重组与鉴定

实验九DNA的重组与鉴定第1页/共42页实验九

DNA的重组与鉴定第2页/共42页一.实验目的

通过本实验学会重组DNA的原理与方法。第3页/共42页基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段第4页/共42页二、实验原理

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有5’磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键，但如果质粒DNA已经去磷酸化，则只能行成2个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。

第5页/共42页实验原理

相邻的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。第6页/共42页

重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛

第7页/共42页多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口第8页/共42页限制性内切酶酶切切酶切第9页/共42页第10页/共42页磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接接第11页/共42页

T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）≤15℃：

15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；第12页/共42页连接方式：

相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接

第13页/共42页粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA连接酶第14页/共42页平端连接

AGCT

TCGAAluⅠDNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGA第15页/共42页重组体的转化受体细胞转第16页/共42页JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态第17页/共42页原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染第18页/共42页2）转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变第19页/共42页CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌第20页/共42页含氨苄平板连接目的基因基因载体连接酶转化重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞第21页/共42页转化后的克隆群体：第22页/共42页1.遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第23页/共42页2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段第24页/共42页X-galLacZ蓝色化合物X-gal第25页/共42页（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶第26页/共42页2电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒

重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段第27页/共42页原位杂交3菌落杂交筛选法第28页/共42页三、实验仪器第29页/共42页超净工作台第30页/共42页台式高速冷冻离心机第31页/共42页恒温空气摇床第32页/共42页恒温培养箱培养皿第33页/共42页恒温水浴锅第34页/共42页四、材料及试剂E.coliDH5α

pUC19orT载体λDNA

第35页/共42页四、材料及试剂1.T4DNA连接酶2．

10×T4DNA连接酶缓冲液:400mmol/LTris-ClpH7.5100mmol/LMgCl2100mmol/LDTT,500μg/mlBSA5-10mmol/LATP第36页/共42页试剂灭菌去离子水

Kac(3mol/L，pH5.2)Xgal(20mg/ml)IPTG(200mg/ml)第37页/共42页五、实验步骤1.

混合以下溶液于一个无菌离心管中

xμlpUC19质粒(0.1-4μg)2μl10×酶切缓冲液

1－5U限制性内切酶（EcoRI）

yμl去离子水终体积为20μl2.在推荐温度下育温1小时（一般为37℃）加入5μl电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。

酶切第38页/共42页实验步骤1．混合以下试剂PCRDNA6μlpUC19酶切回收DNA1.0μl5×T4DNA连接酶缓冲液2.0μlT4DNA连接酶(10u/μl)1μl