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实验一十七同功酶遗传标记分析第1页/共15页实验一十七同功酶遗传标记分析第2页/共15页一、实验目的1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的技术，了解同工酶分析在遗传学研究中的意义2.同工酶遗传标记的分析第3页/共15页二、实验原理同工酶是一类由具有不同分子结构和大小但具有相同催化功能的酶。同工酶分子的多种形式是由基因决定的，也即同工酶是基因表达的直接产物。由同一基因座的不同等位基因编码的各种同工酶又称为等位酶，它们从分子水平上反映了等位基因的相对差异。因此，同工酶不仅是一种生理生化指标，而且也是一种可靠的遗传标记。制备丙烯酰胺凝胶时其凝胶的孔径由凝胶浓度（100毫升凝胶溶液中含有单体和交联剂总克数）决定。当采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系时，一般上层是大孔径的浓缩胶（pH6.8），下层为小孔径的分离胶（pH8.9），电泳缓冲液为Tris－甘氨酸缓冲液（pH8.3）。在这种不连续系统里，存在着电荷效应，分子筛效应和浓缩效应。蛋白质（酶）按其电荷效应和分子筛效应而被分离在凝胶的不同位置上。用此凝胶板与酶反应底物进行催化反应，再用生物染料染色便形成肉眼可见各种酶带。第4页/共15页三、实验材料

水稻（Oryza

Sativa）：二亲本、

F1、F2四种植株群体的幼苗

第5页/共15页四、实验器具和药品

1.用具：电泳仪，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器，玻璃板，离心机等。2.药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）,四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bis），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺，过氧化氢。

第6页/共15页四、实验步骤

第7页/共15页1.种子发芽

取各样品种子100粒，分别置于培养皿内，在30℃之恒温箱中催芽，待芽长出1-2叶，便可进行取样。

第8页/共15页2.制备酶粗提液

一般取样0.5克，置于研钵中，加入1.5mL电极液研磨匀浆后，将样品移至小离心管中离心（3500rpm）15分钟，取上清液，电泳前可在冰箱中保存。

第9页/共15页3.聚丙烯酰胺凝胶系统的配制

分离胶的配制浓缩胶的配制第10页/共15页4.点样

取出样品解冻,以微量注射器吸取样品上清液50微升加入样槽内(注意要针头接近槽底慢慢注入,防止扩散),并在玻璃板上贴上样品编号。

第11页/共15页5.电泳

电泳槽加电极缓冲液，加一滴0.2%溴酚蓝，接好电源，在4℃冰箱中电泳。当溴酚蓝迁至凝胶下端0.5-1cm时停止电泳，电泳时间约3-4小时。第12页/共15页6.染色

将完整的胶板，加入染色液，浸泡凝胶，室温下染色20-30分钟，呈现酶带后取出凝胶，用水漂洗终止染色,洗净后可仍浸于清水内(注意经常换水),亦可制成干片永久保存。

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