曹晓云课件(药典)

《中国药典》2015年版微生物内容

增修订概况及执行中的问题

天津市药品检验所抗生素室曹晓云xiaoyuncao@126.com1当前1页，总共63页。1101无菌检查法1105非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法1106非无菌产品微生物限度限度检查法：控制菌检查法1107非无菌产品微生物限度标准1121抑菌效力检查法

（用于指导生产企业在研发制剂中抑菌剂浓度的确定）1421灭菌法2015年版微生物相关内容收载情况1、6个通则2、制剂通则中9201药品微生物检验替代方法验证指导原则9202非无菌药品微生物限度检查指导原则9203药品微生物实验室质量管理指导原则9204微生物鉴定指导原则（新增）9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（新增）9206无菌检查用隔离系统验证指导原则（新增）3、6个指导原则制剂通则中各制剂项下【无菌】、【微生物限度】及抑菌剂效力检查4、品种正文（原料、辅料、制剂）品种正文中的【无菌】或【微生物限度】（检查方法和限度，或指向通则）5、制药用水灭菌注射用水【无菌】注射用水、纯化水【微生物限度】6、药包材【无菌】或【微生物限度】2当前2页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况2015年版无菌检查法执行中的问题2015年版微生物限度执行中的问题相关通则主要内容制药用水、药包材微生物检测内容3当前3页，总共63页。1101无菌检查法(修订)1105非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法（修订）1106非无菌产品微生物限度限度检查法：控制菌检查法（修订）1107非无菌产品微生物限度标准（修订）1121抑菌效力检查法（修订）1421灭菌法(未修订)9201药品微生物检验替代方法验证指导原则（未修订）9202非无菌药品微生物限度检查指导原则（修订）9203药品微生物实验室质量管理指导原则（修订）9204微生物鉴定指导原则（新增）9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（新增）9206无菌检查用隔离系统验证指导原则（新增）《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况

4当前4页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况

一、整合2010年版一、二、三部合一1101无菌检查法1105非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法1106非无菌产品微生物限度限度检查法：控制菌检查法1107非无菌产品微生物限度标准1421灭菌法2010年版一、二部合一9201药品微生物检验替代方法验证指导原则9202非无菌药品微生物限度检查指导原则9203药品微生物实验室质量管理指导原则5当前5页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况

二、检验方法与国际接轨，涵盖标准和方法的整体变化

无菌检查法

非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法

非无菌产品微生物限度限度检查法：控制菌检查法

非无菌产品微生物限度标准

抑菌效力检查法（2010版为指导原则）

药品微生物检验替代方法验证指导原则药品微生物实验室质量管理指导原则2010年版微生物限度6当前6页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况

三、新理念1、微生物限度的检查结果为不符合规定时，不得复试。2、加强检验过程控制，增订相关指导原则微生物鉴定指导原则（新增）药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（新增）无菌检查用隔离系统验证指导原则（新增）7当前7页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况2015年版无菌检查法执行中的问题2015年版微生物限度执行中的问题相关通则主要内容制药用水、药包材微生物检测内容8当前8页，总共63页。2015年版无菌检查法执行中的问题1、试验环境要求

2010年版2015年版无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品微生物的检出。无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作。9当前9页，总共63页。无菌检查的试验环境要求？通则9203—药品微生物实验室质量管理指导原则

“环境”

—

1、实验室的布局与运行微生物实验的各项工作应在专属的区域进行，以降低交叉污染、假阳性结果和假阴性结果出现的风险。无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域或隔离系统中进行。

2010年版2015年版万级下的局部百级（A+C）A+B或隔离器（建议D级）

1、试验环境要求2015年版无菌检查法执行中的问题10当前10页，总共63页。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对实验环境进行监控。通则9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则通则9206无菌检查用隔离系统验证指导原则1、试验环境监控11当前11页，总共63页。2、无菌检查法首选薄膜过滤法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。一般应采用封闭式薄膜过滤器。3、进行产品的无菌检查时，应进行培养基适用性检查和方法适用性试验。4、检验数量和检验量采用薄膜过滤法时，只要供试品性质允许，应将所有容器内容物过滤。2015年版无菌检查法执行中的问题12当前12页，总共63页。4、检验数量和检验量检验数量检验量指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2规定。表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。除另有规定外，供试品检验量按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。13当前13页，总共63页。4、检验数量和检验量（表1-1）14当前14页，总共63页。4、检验数量和检验量

（表1-2）15当前15页，总共63页。5、保留生物制品无菌检查的特点

除阴性对照外药品生物制品样品检测130～35℃硫乙

硫乙

220～25℃/硫乙

320～25℃TSBTSB阳性对照430～35℃硫乙

硫乙

16当前16页，总共63页。6、培养基体系的修订7、风险评估和偏差调查的要求8、无菌检查结果一次检出为准，不得复试。仅在充分证明试验结果无效后方可重新试验。

17当前17页，总共63页。

供试品的检查培养基适用性检查试验菌液制备方法适用性试验

18当前18页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况2015年版无菌检查法执行中的问题2015年版微生物限度执行中的问题相关通则主要内容制药用水、药包材微生物检测内容19当前19页，总共63页。

通则1105--非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法

1、微生物计数培养基与定义的修订2010年版2015年版细菌数：--生长在营养琼脂培养基上的菌落需氧菌总数：--生长在胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上的所有菌落（细菌、霉菌和酵母菌菌落数）霉菌和酵母菌数：--生长在玫瑰红钠琼脂培养基上的菌落霉菌酵母菌总数：--生长在沙氏葡萄糖琼脂培养基上的所有菌落（包括细菌菌落）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基进行测定）。2015年版微生物限度执行中的问题20当前20页，总共63页。

2、试验环境

2010年版药典：

环境洁净度万级下的局部洁净度百级单向流空气区域内进行。

2015年版药典：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

21当前21页，总共63页。2、试验环境微生物限度检查的试验环境要求？通则9203—药品微生物实验室质量管理指导原则

“环境”

—

1、实验室的布局与运行

微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。

2010年版2015年版万级下的局部百级（A+C）D级背景下的B级(B+D）22当前22页，总共63页。2、试验环境

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

新增通则9205-药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则23当前23页，总共63页。

3、培养基及检验方法适用性试验

培养基和供试品检测所选方法的适用性须经确认。①方法适用性试验（方法验证）②试验组菌落数与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。③加菌步骤提前，加菌量为供试品体积的1%，难度更大。

4、阴性对照如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

24当前24页，总共63页。5、菌种和菌液的制备菌株中国药典协调案枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCMCC(B)63501ATCC6633金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003ATCC6538铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaCMCC(B)10104ATCC9027白色念珠菌CandidaalbicansCMCC(F)98001ATCC10231黑曲霉AspergillusnigerCMCC(F)98003ATCC1640425当前25页，总共63页。5、菌种和菌液的制备

原则：《中国药典》2015年版通则9203-药品微生物实验室质量管理指导原则菌种

“药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株”。标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。26当前26页，总共63页。6、培养条件2010版2015版细菌30～35℃培养3天霉菌和酵母菌23～28℃培养5天，必要时可适当延长7天。除另有规定外，需氧菌总数

30～35℃，培养3～5天；霉菌和酵母菌总数20～25℃培养，5天～7天。27当前27页，总共63页。

各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下：101cfu：可接受的最大限度为20；102cfu：可接受的最大限度为200；103cfu：允许的最大限度为2000：依此类推。7、结果判断28当前28页，总共63页。关于限度标准的表述方式①微生物限度标准以10的指数形式表示：101cfu：可接受的最大限度为20；102cfu：可接受的最大限度为200；103cfu：允许的最大限度为2000：依此类推。

②问题3×104cfu可接受的最大限度为③标准表述为数字的，按数字执行，如，纯化水。取本品不少于1ml，经薄膜过滤法处理，采用R2A琼脂培养基，30～35℃培养不少于5天，依法检查（通则1105），1ml供试品中需氧菌总数不得过100cfu。

29当前29页，总共63页。

限度标准与检验结果的书写限度标准检验结果10的n次幂可接受的最大菌数为2倍按科学计数法

6.9×102cfu具体数字表示即为具体数字

690cfu两种表示方式≠

两种表示方式相等例，内控标准1000cfu/g书写方式①5×102700cfu/g合格？②100030当前30页，总共63页。8、不得复试，无相关内容31当前31页，总共63页。通则1106--非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法

1、培养基变化

在增菌过程，使用无选择性增菌培养基培养。疑似菌增加，工作量加大。

2、结果判断方式变化

在各控制菌项下：改为“较少的生化实验”，以及“应进一步进行适宜的鉴定试验”。

——较大变动

3、以“耐胆盐革兰阴性菌”，取代“大肠菌群”。2015年版微生物限度执行中的问题32当前32页，总共63页。通则1107--非无菌药品微生物标准

1、需氧菌总数限度放宽，部分霉菌和酵母菌限度提高

2015年版微生物限度执行中的问题33当前33页，总共63页。非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准

非无菌化学药品及生物制品微生物限度标准(表1)制剂类型需氧菌霉菌、酵母菌控制菌口服给药固/液体①103102102101不得检出大肠埃希菌；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌口腔黏膜/齿龈/鼻用102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌耳用/皮肤102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌呼吸道吸入102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰氏阴性菌阴道/尿道102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、梭菌（中药制剂）直肠给药固/液体103102102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌其他局部给药102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌局部用药注①化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成分及矿物质还不得检查沙门菌。34当前34页，总共63页。非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（表2）制剂类型需氧菌霉菌、酵母菌控制菌固体口服给药-含豆豉神曲等发酵原粉-不含豆豉神曲等发酵原粉105104（丸剂3×104）5×102102大肠埃希菌，沙门菌，耐胆盐的阴性菌应小于102个液体口服给药-含豆豉神曲等发酵原粉-不含豆豉神曲等发酵原粉1035×102102102大肠埃希菌，沙门菌，耐胆盐的阴性菌应小于101个固体局部给药-表皮或黏膜完整-表皮或黏膜不完整104103102102金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，阴道&尿道给药制剂不得检出白色念珠菌、梭菌。液体局部给药-表皮或黏膜完整-表皮或黏膜不完整102102金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，阴道&尿道给药制剂不得检出白色念珠菌、梭菌。NationalInstituteofFoodandDrugControlHttp://35当前35页，总共63页。不得检出沙门菌：口服制剂①含脏器提取物②含有未经提取的动物、植物及矿物质来源的成分③含生粉的中药制剂耐胆盐革兰阴性菌：口服制剂表1：①呼吸道吸入给药制剂不得检出（定性）表2：②固体制剂＜102cfu/g（定量）

③

液体制剂＜101cfu/g（定量）36当前36页，总共63页。指数形式表示标准放宽固体：不易繁殖，标准最低。局部：粘膜系统或易感部位—特殊用药途径较高（霉酵提高）液体：易繁殖，标准较高（霉酵提高）37当前37页，总共63页。非无菌产品微生物限度标准原辅料、饮片-限度.doc中药饮片：中药研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片38当前38页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况2015年版无菌检查法执行中的问题2015年版微生物限度执行中的问题相关通则主要内容制药用水、药包材微生物检测内容39当前39页，总共63页。相关通则主要内容---通则1121抑菌效力检查法1、将原指导原则，修订为检查法。对抑菌剂的选择和抑菌效力的监控更加重视。2、用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。3、分三类，每类分A和B标准。

①注射剂、眼用制剂、用于子宫和乳腺的制剂。②耳用制剂、鼻用制剂、皮肤给药制剂、吸入制剂。③口服制剂、口腔黏膜制剂、直肠给药制剂。40当前40页，总共63页。相关通则主要内容

---通则9202非无菌药品微生物限度检查指导原则1、控制菌检查法没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。若供试品检出疑似致病菌，确证方法应选择已被认可的菌种鉴定方法，如，细菌鉴定一般依据《伯杰氏系统细菌学手册》。2、用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求。对创伤程度难以判断的如没证据证明药品不存在安全性风险那么该药品应符合无菌检查要求。3、在制定原辅料微生物限度标准时，应根据原辅料的微生物污染特性、用途、相应制剂的生产工艺及特性等因素，还需控制具有潜在危害的致病菌。41当前41页，总共63页。相关通则主要内容

---通则9203药品微生物实验室质量管理指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。1.名称“药品微生物实验室规范指导原则”修订为“药品微生物实验室质量管理指导原则”42当前42页，总共63页。相关通则主要内容

---通则9203药品微生物实验室质量管理指导原则2.整体框架修订前：人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断修订后：人员、培养基、试剂、菌种、环境、设备、样品、检验方法、污染废弃物处理、检测结果质量保证和检测过程质量控制、实验记录、结果的判断和检测报告、文件。43当前43页，总共63页。相关通则主要内容

---通则9204微生物鉴定指导原则为非无菌产品微生物限度检查中控制菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指导。

1、微生物的鉴定结果以《伯杰氏系统细菌学手册》第二版(《Bergey＇sManualofSystematicBacteriology》SecondEdition)为准。

2、鉴定程序：分离纯化、初筛试验、表型鉴定、基因型鉴定。

3、溯源分析44当前44页，总共63页。相关通则主要内容

---通则9205药品洁净室微生物监测和控制指导原则用于指导药品微生物检验用洁净室等受控环境微生物污染情况的监测和控制。

1、人员要求

2、初次使用的洁净实验室参数确认

3、监测:微生物检测方法、监测频次及监测项目、监测标准、警戒限和纠偏限、数据分析及偏差处理、微生物鉴定

4、微生物控制45当前45页，总共63页。相关通则主要内容

---通则9206无菌检查用隔离系统验证指导原则是为药典要求无菌的药品、生物制品、原料、辅料、及其他品种无菌检查用隔离系统的验证提供指导。无菌隔离系统从根本上避免了操作人员与实验用物品的直接接触。

1、隔离器的结构

2、隔离器的安装位置的选择

3、隔离系统验证

4、隔离器的应用46当前46页，总共63页。《中国药典》2015年版微生物内容增修订概况2015年版无菌检查法执行中的问题2015年版微生物限度执行中的问题相关通则主要内容制药用水、药包材微生物检测内容47当前47页，总共63页。制药用水是药品生产中用量最大、使用最广的一种辅料，贯穿于生产的全过程。药典所收载的制药用水，根据因其使用的范围不同而分为饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水。制药用水的原水通常为饮用水。制药用水微生物检验方法的修订主要涉及纯化水及注射用水。制药用水微生物检验方法与标准

当前48页，总共63页。

1、美国药典和欧洲药典方法情况美国药典通则〈1231〉制药用水中，弹性标准，推荐方法给出的是高营养类型的培养基TSA。欧洲药典明确规定的是R2A培养基。

当前49页，总共63页。2、制药用水微生物检验方法课题研究结果课题研究框架

课题组通过对13家制药企业的纯化水系统共计90个水样，采用不同的培养基体系、培养条件以及检测方法进行实验研究，共取得了5000多个实验数据。13家制药企业涵盖了国内制药企业、中外合资制药企业、外资制药企业以及医院制剂室，且地域分布适宜，具有较好的代表性。

当前50页，总共63页。

课题研究重点考察内容（培养体系、方法、国产进口不同厂家培养基）

1）培养体系的三要素培养基3种TSAR2A营养琼脂培养温度2个20～25℃30～35℃

培养时间4个48h72h96h120h当前51页，总共63页。

课题试验结果考察培养体系的三要素的结果：从统计结果来看，3要素中对计数结果起主导作用的是培养时间，无论哪种培养基、培养温度，只要延长培养时间，都能使计数结果数值增大，但相同培养时间，不同培养要素（培养基种类和培养温度）的两两组合对实验结果仍有影响。将134组有效数据进行统计，结果表明，R2A，30～35℃，120hr表观累加计数结果数值最高。

当前52页，总共63页。20组有效数据采用Excel作配对t检验（显著性水平为0.05），统计结果表明，2种检测方法的计数结果均无显著性差异（P＞0.05）。平皿法和薄膜过滤法结果无显著差异（高污染水平）平皿法相具有费用低、检测方法简便的优势薄膜过滤法相比平皿法的优势在于检测更大的样本量，以保证所得到的数据更具有统计学意义。平皿法薄膜过滤法R2A，30～35℃，120hrR2A，30～35℃，120hrTSA，30～35℃，72hrTSA，30～35℃，72hr2）考察不同的检测方法计数结果差异当前53页，总共63页。

水系统微生物监测的目的，是要持续提供足够的有关制药用水中微生物监控的数据，来制订微生物污染的警戒限和行动限水平，并用于趋势分析，使得水系统的微生物数量可以控制在一定的水平。因此，认为在低污染水平的水系统则更适合选择样本量大的薄膜过滤法，持续跟踪水系统的微生物状态。当前54页，总共63页。新修订方法及在执行过程中可能遇到的问题

纯化水质量标准的修订

修订前

修订后取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录ⅪJ），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。取本品不少于1ml，经薄膜过滤法处理，采用R2A琼脂培养基，30-35℃培养不少于5天，依法检查（通则1105），1ml供试品中需氧菌总数不得过100cfu。当前55页，总共63页。新修订方法及在执行过程中可能遇到的问题

纯化水质量标准的修订

R2A琼脂培养基适用性试验照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数（通则1105）中“计数培养基适用性检查”的胰酪大豆胨琼脂培养基的适用性检查方法进行，试验