发酵工艺学菌种选育2

发酵工艺学菌种选育演示文稿当前1页，总共64页。发酵工艺学菌种选育当前2页，总共64页。菌种选育目的提高产量产生新的生物活性物质改变产品质量和组分简化工艺，缩短周期抵抗不良环境适应新的原材料提供分子遗传研究材料研究生物合成调控机理分析生物合成途径获得带遗传标记的菌株了解菌种遗传背景生产科研当前3页，总共64页。青霉素生产菌种选育1928年，Fleming,点青霉2U/mL1943年，一农妇的发霉甜瓜上分离到一株产黄青霉，120U/mL经诱变，WisQ176，900U/mL目前工业发酵水平：85000U/mL当前4页，总共64页。菌种选育的基本内容:

根据菌种自然变异而进行的自然选育。用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种,再按照工业生产的要求进行筛选来获的新的变种或杂种。包括诱变育种、杂交育种、原生质体育种、基因工程育种。当前5页，总共64页。自然选育概念：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，选择维持原有生产水平的菌株的纯种选育的方法。当前6页，总共64页。纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体菌种为何会退化和变异？当前7页，总共64页。1.1菌种退化和变异的原因总的来说：内因＋外因遗传

2.自发突变的结果可能原因：

1）沙土管长期保藏2)连续传代

3）新陈代谢产生的诱变物质

4）增变基因、死亡基因的存在3.经诱变剂处理后的退化变异。

当前8页，总共64页。生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落1.2自然选育流程图为何进行复筛？生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落移种进一步选育或保藏斜面种子(初筛)高产菌株沙土管菌株斜面种子摇瓶复筛高产纯化株生产试验生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落自然选育是一种纯种选育的方法当前9页，总共64页。优点：简单易行缺点：效率低、进展慢难以获得高产突变株

以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。目的：纯化、复壮菌种当前10页，总共64页。§2诱变育种2.1概念：以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。当前11页，总共64页。2.2优点：速度快、收效大、方法简单是当前的一种主要方法2.3理论基础：基因突变(诱发突变)当前12页，总共64页。诱发突变重要概念突变：由于染色体或基因本身的变化而产生遗传性状的变异。表型迟延：表型改变落后于基因型改变的现象。诱变过程当前13页，总共64页。突变的诱发过程

1.诱变剂接触DNA分子及对DNA分子的损伤

2.DNA损伤的修复：五种方式

3.从突变到突变型分离性延迟和生理性延迟可理解为“质”和“量”

16当前14页，总共64页。DNA损伤修复的五种方式光复活作用切补修复重组修复SOS修复系统DNA多聚酶的校正作用有利于突变的发生当前15页，总共64页。2.4诱变育种方案设计制定筛选目标诱发突变常用诱发剂及其特点诱变剂的选择

不稳定菌株－－－－温和诱变剂稳定菌株－－－－强烈的、广谱的诱变剂低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性C.突变株的筛选当前16页，总共64页。物理诱变剂紫外线、X-射线、

γ-射线、

快中子

特点：紫外线方便、有效、使用安全，其他的几种射线有一定的穿透力化学诱变剂

碱基类似物、吖啶类、烷化剂

特点：高效、经济、但应注意使用安全当前17页，总共64页。各种诱变的机制……当前18页，总共64页。筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。当前19页，总共64页。2.5诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选当前20页，总共64页。当前21页，总共64页。出发菌株的选择

1.选择纯种

2.平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度要小，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。3.有良好的代谢特性。4.选择对诱变剂敏感的菌株。5.选用多个出发菌株进行诱变收效较快。

当前22页，总共64页。诱变剂的选择

野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。当前23页，总共64页。要考虑诱变剂的作用机理来选择诱变剂，两种诱变剂复合使用效果好。最适剂量(有2种观点)：杀菌率90%－99%较好，甚至99.9%;杀菌率75%－85%。

当前24页，总共64页。2.6突变株的筛选（Selection）随机筛选

(Randomselection)摇瓶筛选法

初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，并要重复3-5次，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。

复杂、耗时

当前25页，总共64页。琼脂块筛选法

简单、快速，但不准确自动化筛选（筛选几千个菌落数/天）当前26页，总共64页。理性化筛选又称定向筛选

(Orientedselection)

运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。当前27页，总共64页。反馈：指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。反馈抑制：指反应途径中某些中间产物或末端产物降低该途径中前面酶催化的反应速度。末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径。反馈阻遏：代谢的终产物达到一定浓度时，对该代谢途径前面的一种酶或几种酶的生物合成产生阻碍作用。当前28页，总共64页。

普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏，要打破反馈调节系统，可从两个方面着手：

(1)降低终产物浓度筛选细胞膜透性改变的突变株例如，谷氨酸发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型。2)初级代谢产物高产菌株的筛选当前29页，总共64页。筛选营养缺陷型突变株

营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。

渗漏缺陷型:是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，能少量地合成某一代谢产物。当前30页，总共64页。基本培养基(MM)：能满足野生型菌株正常生长的培养基minimalmedium补充培养基(SM)：在基本培养基中加入相应的营养成分的培养基supplementalmedium完全培养基(CM)：能满足各种营养缺陷型生长的称培养基CompleteMemum当前31页，总共64页。筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱当前32页，总共64页。淘汰野生型抗生素法：由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，在MM中一定量的抗生素，杀死活化状态的野生型，保存了休眠状态的缺陷型细菌－青霉素，酵母－制霉菌素菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过当前33页，总共64页。检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。

具体方法：影印法、点种法、夹层法

当前34页，总共64页。当前35页，总共64页。生长谱测定的方法

将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5-6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。一个平皿测一个菌。当前36页，总共64页。

以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5－6个平皿上可测20株菌以上。当前37页，总共64页。(2)筛选抗反馈调节突变株筛选结构类似物抗性突变株

结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物

特点：有反馈调节作用

无正常生理功能

筛选方法：浓度梯度法（补充）利用回复突变筛选抗反馈突变菌株当前38页，总共64页。当前39页，总共64页。诱变育种实例：

赖氨酸高产菌株选育当前40页，总共64页。天冬氨酸黄色短杆菌的代谢过程甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸激酶天冬氨酸β－半醛抑制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶(HD)当前41页，总共64页。黄色短杆菌的代谢特点天冬氨酸激酶（AK），是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys（赖氨酸）、Thr（苏氨酸）的协同反馈抑制

协同反馈抑制：该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。

当前42页，总共64页。两个分支点的优先合成机制：优先合成高丝氨酸Hos，再优先合成蛋氨酸Met当Met过量时阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶，使代谢流向合成Thr的方向进行当Thr过量时反馈抑制高丝氨酸脱氢酶，使代谢流向Lys的合成上。（Met＞Thr＞Lys）当前43页，总共64页。天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高丝氨酸高丝氨酸磷酸O-琥珀酸高丝氨酸二氢吡啶-2,6-二羧酸赖氨酸苏氨酸蛋氨酸天冬氨酸当前44页，总共64页。育种途径切断或减弱代谢支路

切断或减弱合成Met、Thr的分支途径——选育营养缺陷型突变株当前45页，总共64页。可选用Hos-，其意义在于：

解除了Hos的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。

当前46页，总共64页。在培养基中限量的供给Met、Thr（或者Hos），对于AK酶活性的调节有着重要意义。因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。

当前47页，总共64页。双重营养缺陷型突变株（Met-+Thr-）,其本质和Hos-相同。优点：遗传性质稳定，回复突变的几率少。当前48页，总共64页。天冬氨酸人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸中间产物Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物Ⅱ甲硫氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶不能合成可以大量积累赖氨酸人工诱变的菌种不能产生当前49页，总共64页。解除反馈调节（—反馈阻抑）

从理论上讲，选育Hom-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hom-是不够的。为了高效率的转化Lys，需要解决这一问题：使该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？

当前50页，总共64页。选育结构类似物抗性突变株？（Xr）

S-L-半胱氨酸抗性突变株AECr

（效果最佳，应用最广）γ-甲基赖氨酸抗性突变株MLrL-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr

苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株ThrHxr当前51页，总共64页。L-Lys:CH2(NH2)-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)COOHAEC:CH2(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)COOH结构类似物AEC物的作用机制：起反馈抑制作用

AEC与L-Lys结构相似，被天冬氨酸激酶所误认，与Thr一起在天冬氨酸激酶的变构部位上结合，协同抑制酶活。抗结构类似物突变株的实质：天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变。当前52页，总共64页。1、筛选营养缺陷型突变株。2、筛选抗性突变突变株

磷酸盐、碳源调控菌株。

氨基酸结构类似物抗性突变株

二级金属离子抗性突变菌株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株

筛选自身代谢产物抗性突变株

抗噬菌体、温度敏感等

当前53页，总共64页。次级代谢产物高产菌株的筛选1、筛选营养缺陷型突变菌株（分支合成途径）氯霉素合成途径氯霉素由莽草酸途径合成，同时还有芳香族氨基酸，会产生反馈抑制。通过诱变筛选，阻断莽草酸到芳香族氨基酸的途径，可增加氯霉素的产量。氯霉素当前54页，总共64页。2、筛选去磷酸盐调节突变株许多抗生素等次级代谢产物的生物合成明显受到磷酸盐的调控，当培养基中磷酸盐的含量超过一定限度，这种代谢产物的合成就受到明显的抑制作用。通过固体琼脂块发酵，加入过量磷酸盐，观察抑菌圈的大小。当前55页，总共64页。3、筛选去除碳源分解代谢调节突变株许多能被菌株快速利用的碳源往往对许多次级代谢产物的合成产生阻遏或抑制作用。青霉素发酵中的葡萄糖效应不但抑制抗生素的生物合成，而且抑制某些碳氮源的分解利用。由于葡萄糖对菌体内的分解氮源的酶产生抑制作用，使菌体不能分解利用唯一的氮源组氨酸，菌体不能生长。诱变菌株，涂布到组氨酸和葡萄糖的培养基上原因：葡萄糖分解代谢的酶发生了变化，不再产生和积累分解代谢阻遏物。当前56页，总共64页。例2筛选葡萄糖结构类似物抗性突变菌株利用葡萄糖结构类似物2-脱氧葡萄糖，不能被菌体利用，但具有葡萄糖的碳源分解产物阻遏作用，在用乳糖和2-脱氧葡萄糖为碳源，阻遏乳糖利用，筛选少量生长菌落。当前57页，总共64页。4、筛选氨基酸结构类似物抗性突变株许多次级代谢物都是以初级代谢产物如氨基酸等做为前体生物合成这些次级代谢产物。当这种氨基酸前体成为次级代谢产物生物合成的限制因素的时候，筛选这种氨基酸结构类似物抗性突变株，解除这种氨基酸的反馈调节，可提高氨基酸的胞内量，进而提高代谢产物的合成。当前58页，总共64页。例1、青霉素合成途径中，半胱氨酸和缬氨酸是生物合成青霉素母核的前体，筛选抗半胱氨酸结构类似物或抗酰胺酸结构类似物的抗性突变株，可提高半胱氨酸或缬氨酸的生成量，进而提高青霉素产量。当前59页，总共64页。5、筛选二价金属离子抗性突变株过量的二价金属离子对菌体有毒害，有些次级代谢产物可以与二价金属离子形成盐，降低金属离子的毒害作用，代谢产物越多，解毒作用越强。诱变后涂布到高浓度二价离子培养基上，能长出来的可能是高