j第八章 目的基因的表达

第八章克隆基因的表达当前1页，总共166页。遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。一、基因表达：当前2页，总共166页。二、克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。当前3页，总共166页。用原核生物作宿主AdividingE.coli第一节外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子当前4页，总共166页。识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA聚合酶当前5页，总共166页。5’3’转录mRNA5’3’翻译蛋白质NC5’3’3.转录和翻译偶联、连续进行。当前6页，总共166页。当前7页，总共166页。4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。含有一个启始密码子和一段同核糖体16SrRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:当前8页，总共166页。二、原核表达系统的注意事项!外源基因不能带有内含子。2.必须用cDNA3.不能直接用真核基因组DNA。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。当前9页，总共166页。是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。三、原核生物基因表达的调控1.启动子-35Box和-10Box（1）启动子序列当前10页，总共166页。consensussequences当前11页，总共166页。5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT转录起始位点17bp5’核糖体结合位点RNA聚合酶亚基的识别位点。①-35box当前12页，总共166页。原核启动子共有序列的功能当前13页，总共166页。（2）翻译的起始位点①核糖体结合位点（RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译当前14页，总共166页。AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游。ii）起始密码：当前15页，总共166页。2.转录终止子内终止子intrinsicterminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子当前16页，总共166页。由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作①茎环结构②多聚A/U当前17页，总共166页。5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)转录↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓mRNA折叠UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脱落当前18页，总共166页。当前19页，总共166页。大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。4.翻译增强子Translationenhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。213.翻译终止密码当前20页，总共166页。①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件5.基因工程常用的原核启动子p87当前21页，总共166页。来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的基因（2）乳糖启动子lac当前22页，总共166页。（3）色氨酸启动子trptrpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2启动子；O操纵基因；衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。当前23页，总共166页。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA邻氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶链链分支酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖基邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物转录（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。当前24页，总共166页。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸结合不转录用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为corepressor）。当前25页，总共166页。当前26页，总共166页。当前27页，总共166页。四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达（1）包涵体（inclusionbody）P93是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。当前28页，总共166页。在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。②缺点①优点当前29页，总共166页。2.周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。当前30页，总共166页。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等（3）常用的原核信号肽①大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。（2）信号肽（signalpeptide）当前31页，总共166页。鼠源RNase、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。（2）真核信号肽④胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。②金黄色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（endoglucanase）。当前32页，总共166页。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3.胞外表达或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。当前33页，总共166页。当前34页，总共166页。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG优点五、几种类型的原核表达载体1.非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。当前35页，总共166页。哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。（1）pKK223-3载体P87组成结构：①强启动子:tac（trp-lac）:trp的-35区lacUV5的-10区lac操纵基因②操纵基因：乳糖操纵子系统。当前36页，总共166页。④终止子：③调节基因：LacI宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如JM105菌。rrnB的强终止子rrnB强终止子S-D插入位点区⑤S-D序列和插入位点区：当前37页，总共166页。tacPLacOS-D插入位点区rrnBT宿主lacI⑥载体的其余部分：来自pBR322质粒。⑦表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG当前38页，总共166页。必须选择一个有lacI的宿主菌。条件：当前39页，总共166页。载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pINIII系列：2.分泌型表达载体P92pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）组成结构当前40页，总共166页。IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。②调节基因：lacI③S-D序列和起始密码ATG。④分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位点区（多克隆位点）。①强启动子：当前41页，总共166页。pINIII-comA1以pBR322为基础构建的。调节基因不必借助于宿主的lacI.当前42页，总共166页。表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI④S-D序列3.融合蛋白表达载体系统----pGEX系列P90（1）优点（2）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。22当前43页，总共166页。lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。（3）产物提纯当前44页，总共166页。（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用当前45页，总共166页。pGEX插入区：pGEX-1TCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCATCGTGACTGACTGACGALeuValProArgGlySerProGluPheIleValThrAspEcoRIBamHI凝血酶当前46页，总共166页。

CTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACGLeuValProArgGlySerProGlyIleHisArgAspEcoRIBamHI凝血酶ATCGAAGGTCGTGGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACIleGiuGlyArgGlyIleProGlyAsnSerSerEcoRIBamHIXa因子pGEX-2X的插入区：pGEX-3X的插入区：SmaISmaI当前47页，总共166页。（5）其他融合蛋白系统P91His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。当前48页，总共166页。5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）六、影响外源基因表达效率的因素1.启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶σ亚基的识别位点（1）一致顺序当前49页，总共166页。（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACATATAAT一致顺序lactrpPLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box当前50页，总共166页。5’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.翻译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列？？？？当前51页，总共166页。AUG左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。当前52页，总共166页。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3-9个碱基。

在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。（3）其它当前53页，总共166页。3.启动子与外源基因之间的距离当前54页，总共166页。转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。4.转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。当前55页，总共166页。选择强启动子序列，如tac等七、提高表达水平常用的方法2.调整S-D序列与AUG碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子一般为3-9bp。能提高翻译的起始效率。当前56页，总共166页。4.增加mRNA的拷贝数和稳定性5.减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达一般采用温度诱导或药物诱导。去除转录物内的衰减和非特异终止，加入抗终止的序列元件，加放正常转录终止序列。选用RNase缺失的受体菌当前57页，总共166页。cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。32°C:42°C:cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。cI857PL外源基因POPL启动子是温度诱导型当前58页，总共166页。调节基因lacI（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。无IPTG:阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。有IPTG:阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。tac启动子是药物诱导型当前59页，总共166页。（2）表达载体诱导复制将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。当前60页，总共166页。N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物目的基因产物NC切割6.提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。当前61页，总共166页。①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变也减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。当前62页，总共166页。（3）表达分泌蛋白细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。当前63页，总共166页。细菌蛋白分泌的条件：位于N端，一般为15-30aa。真核与原核的结构相似,功能相似，可以互换。碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶外源蛋白

①有信号肽。当前64页，总共166页。③细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。②蛋白质内有与分泌相关的aa序列。为蛋白指明目的地。当前65页，总共166页。九、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1.形成正确的二硫键当前66页，总共166页。人胰岛素分子当前67页，总共166页。抗体分子人血红蛋白分子当前68页，总共166页。如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。2.前体切割当前69页，总共166页。（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。3.蛋白质糖基化糖基当前70页，总共166页。（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖当前71页，总共166页。磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化4.氨基酸残基的修饰羟脯氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸当前72页，总共166页。缺乏蛋白质的加工。（如糖基化、氨基酸修饰等）。十、原核细胞表达的缺陷当前73页，总共166页。酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节外源基因在真核细胞中的表达真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因当前74页，总共166页。①能在E.coli中克隆和扩增。1.酵母克隆载体一、在酵母中表达P275Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④有合适的克隆位点。③有酵母的选择标记Ori②有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。当前75页，总共166页。DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells当前76页，总共166页。由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。ColE1酵母Leu2+如PYeleu10:（1）整合型载体(YIp)当前77页，总共166页。①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。特点：载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。②不能在酵母细胞中自主复制③整合到酵母的染色体上④不能从酵母细胞中提取载体。当前78页，总共166页。由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。大肠杆菌质粒酵母ARS（2）复制型载体(YRp)酵母选择标记当前79页，总共166页。ARSARS（automouslyreplicatingsequence）:ATTTTATATTTATGT250bp保守区当前80页，总共166页。特点：①转化率高（102-103转化子/微克DNA)。④不稳定，容易丢失。②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。③穿梭载体（shuttlevector）当前81页，总共166页。在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。特点：YRp质粒酵母着丝粒（3）着丝粒质粒(YCp)③不易从细胞中提取。①行为像染色体，能稳定遗传。②单拷贝存在。当前82页，总共166页。由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。大肠杆菌质粒酵母选择标记2m质粒如pYF92:pBR3222m酵母his3+（4）附加体型载体(YEp)当前83页，总共166页。2m质粒：酿酒酵母的内源质粒，长度是2m。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。当前84页，总共166页。特点：①很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）.②拷贝数多（25-100分子/细胞）。③比YRp稳定。当前85页，总共166页。YEp24当前86页，总共166页。Leu-

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上，或独立在酵母细胞内转化Leu营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长酵母载体大肠杆菌提取插入外源基因鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化2.酵母转化和表达的一般过程当前87页，总共166页。（1）优点①对其遗传学和生理学的研究比较深入。②小量培养和大规模反应器中都能生长。③已经分离出很强的启动子。④有翻译后的加工。⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不需要宿主的安全性检验。3.酵母表达系统的特点当前88页，总共166页。②常常发生质粒丢失。③重组蛋白常常超糖基化①表达量普遍低。（2）缺点每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，④分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，当前89页，总共166页。4.在啤酒酵母中表达的重组蛋白当前90页，总共166页。24当前91页，总共166页。（1）细胞质内表达例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：5.在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶表达出的SOD修饰正确：起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶)当前92页，总共166页。宿主：亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸脱氢酶当前93页，总共166页。（2）表达分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：构建载体在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。前导肽（leaderpeptide）：当前94页，总共166页。蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。信号肽的切割：前导肽Lys-Arg重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶当前95页，总共166页。6.其它酵母表达系统（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！①嗜甲烷酵母（Pichiapastoris）的特点当前96页，总共166页。HBsAg:乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。②表达载体构建（整合型）：诱导物：甲醇。产量：9×106剂疫苗/240L发酵罐。当前97页，总共166页。整合到染色体中当前98页，总共166页。（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料添加剂促进反刍动物消化。产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。当前99页，总共166页。二、昆虫培养细胞表达系统1.杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：两种形式①单独病毒粒子形式病毒粒子宿主细胞病毒粒子侵染释放当前100页，总共166页。病毒粒子宿主细胞侵染宿主细胞侵染合成多角体蛋白裂解释放多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographacaliforniamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）②多面体形式当前101页，总共166页。（2）杆状病毒的表达特点①感染后36-48h，病毒开始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的启动子特别强。③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响病毒的繁殖。当前102页，总共166页。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。3.转化子筛选通过显微镜检查看是否有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。2.最普遍应用的宿主细胞株当前103页，总共166页。（1）转移载体的构建大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。4.杆状病毒转化载体杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点当前104页，总共166页。转移载体当前105页，总共166页。（2）杆状病毒载体转化过程①转移载体中插入外源基因②转移载体与野生型AcMNPVDNA共同转染宿主细胞③转移载体与病毒基因组发生双交换④外源基因被交换转入病毒基因组中⑤重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。当前106页，总共166页。当前107页，总共166页。4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白当前108页，总共166页。5.杆状病毒大规模表达存在的问题杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。（1）寿命短感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。（2）共同转染率低重组率更低。0.1%-1%。当前109页，总共166页。三、外源基因在植物中表达根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti质粒:当前110页，总共166页。Tiplasmid当前111页，总共166页。环状双链DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相当于细菌染色体的3%-5%）。（1）Ti质粒的结构当前112页，总共166页。转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成①T-DNA（transfer-DNA）生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶iaaM:色氨酸-2-单加氧酶当前113页，总共166页。色氨酸-2-单加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶,催化：二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）5’-AMP当前114页，总共166页。章鱼碱（octopine)胭脂碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg与丙酮酸缩合成Arg与酮戊二醛缩合成冠瘿碱（opine）的类型和化学结构当前115页，总共166页。农杆碱（agropine）冠瘿碱（opine）的作用冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。Glu的二环糖衍生物。当前116页，总共166页。②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIRD2蛋白结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。单链的5’端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。当前117页，总共166页。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：③冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。当前118页，总共166页。（1）第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。2.农杆菌的感染和生存当前119页，总共166页。（1）第二步感染植物（3）第三步毒性基因（vir）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步诱导冠瘿瘤当前120页，总共166页。当前121页，总共166页。（6）第六步土壤农杆菌代谢冠瘿碱。当前122页，总共166页。3.Ti质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（opine），分为（1）章鱼碱（octopine)型质粒当前123页，总共166页。（3）农杆碱（agropine）型质粒（2）胭脂碱（nopaline）型质粒当前124页，总共166页。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。（3）强启动子4.Ti质粒转化的对象5.Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。25当前125页，总共166页。（1）分子量太大（120kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。6.天然Ti质粒作载体的缺点当前126页，总共166页。（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。7.Ti质粒的改造当前127页，总共166页。改造后的Ti质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect当前128页，总共166页。8.Ti载体的类型（1）共整合载体（cointegratevectors）最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。①pGV3850的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。当前129页，总共166页。当前130页，总共166页。宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。1）脓杆菌选择标记2）最终受体植物的选择标记②选择标记卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）当前131页，总共166页。③外源基因插入pGV3850的过程当前132页，总共166页。转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物当前133页，总共166页。（2）双元载体（binaryvectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（<10kb）①双元载体的结构Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）当前134页，总共166页。当前135页，总共166页。②双元载体的转化转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。1）基因插入2）帮助质粒（helperplasmid）Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。当前136页，总共166页。左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达E.coli当前137页，总共166页。（3）三亲融合法(triparentalmatig)含双元载体的大肠杆菌：含有外源基因和左右边界。含有帮助质粒的辅助细菌：含vir基因。受体农杆菌（空）：三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。三亲当前138页，总共166页。四、在哺乳动物细胞中表达1.动物细胞基因克隆和表达载体---SV40病毒常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simianvacuolatingvirus40）改造而来的。当前139页，总共166页。①20面体外壳：由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。5243bp的环状双链。②DNA：（1）SV40病毒的结构当前140页，总共166页。SV40猿猴细胞细胞裂解释放SV40啮齿类细胞细胞癌变SV40DNA整合到寄主染色体上permissivenonpermissive（2）SV40感染和生存方式当前141页，总共166页。T-抗原（tumorantigen）:两个6聚体的T抗原结合在SV40DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。(3)SV40DNA的复制①解链SV40编码的蛋白。功能是在SV40DNA复制的时候解开DNA双链。当前142页，总共166页。当前143页，总共166页。当前144页，总共166页。T抗原SV40DNA双链当前145页，总共166页。②SV40复制起始位点5’-CTCACTACTTCTGGAATAGC3’-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期回文序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA2147T抗原结合位点GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT

TATTTTTTTTAATCAG富含AT区4869当前146页，总共166页。①早期表达区：(4)SV40病毒的转录和翻译编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。②晚期表达区：在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白。当前147页，总共166页。对非受纳细胞（nonpermissivecells），只有T抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿主染色体上。SV40整合(5)SV40病毒的整合有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。(6)SV40病毒的包装当前148页，总共166页。①去掉一部分DNA(T抗原或者VP基因）。②助手型SV40去掉T抗原基因的病毒，保留晚期复制启动子。提供外壳蛋白。(7)SV40基因组的改造不能复制，但能包装。当前149页，总共166页。需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入SV40的外源基因复制，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩增。去掉VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达启