重组体的筛选与鉴定

关于重组体的筛选与鉴定第一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第六章

重组体克隆的筛选和鉴定第二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四转化子和重组子转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子成为重组子。如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子第三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四选择(selection)筛选(screening)选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。第四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四

根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。第五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四转化率的影像因素1.载体DNA及DNA重组方面载体自身性质，不同载体的转化效率不同载体分子的空间构象（超螺旋与线性）2.受体细胞受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体DNA性质相匹配3.转化操作方面受体细胞的预处理感受态细胞的制备如：Ca2+诱导的转化细胞与菌龄、氯化钙处理时间（12~24h）感受态的保存期、热脉冲时间等4.转化后重组子的整合与表达第六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四遗传学选择法（geneticselection）：主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型变化直接选择重组体的方法。抗药性、显色、营养缺陷等2.物理筛选方法：3.核酸杂交法4.表达产物分析法筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携带有外源插入片段的重组体挑选出来PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆〔‘〕。随后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2基因进行了定点突变〔’〕；Zimmer等用PCR方法筛选出同源异型盒基因hoxl.l定点突变的ES细胞克隆，并得到含该突变的嵌合体小鼠第七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。

Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。第一节

载体表型选择法1.原理：第八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四pBR322第九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：第十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活第十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四无环丝氨酸培养基第十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。第十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（

片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。第十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终止密码；（不破坏肽）。2.选择过程第十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。第十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：第二节

根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长第十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状降解第十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节

DNA电泳检测法

分子量Marker载体重组克隆第十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四二、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。第二十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四酶切前酶切后插入片断载体第二十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四ABA或B第二十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第二十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四不同克隆的酶切结果第二十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四筛选过程第二十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并进行克隆,在前者的克隆中筛选到A基因,但在后者的克隆中未筛选到A基因,请说明原因.

第二十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。第二十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四1.核酸杂交第四节

核酸杂交检测法

一、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标记32P或

125I。（1）放射性同位素2.检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。（2）非放射性标记荧光素第二十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。第二十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四酶切前酶切后插入片断载体第三十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四Southernblot筛选结果第三十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。第三十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第三十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四（2）R-环检测法DNA-RNA杂交。1）原理：2）选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。第三十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四缺点：需要电镜！第三十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四2.Northernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。第三十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第五节

免疫化学检测法

在某些情况西下,如待测的重组克隆子既无任何可供选择的基因表型特征,又无理想的核酸杂交探针时,可以考虑采用免疫化学检测法.抗体检测法免疫沉淀检测法第三十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法1.抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”

第三十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗第三十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四2.放射性抗体检测法过程第四十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四3.Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因A插入基因B表达质粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。第四十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四固相支持滤膜抗A抗体125I标记的抗B抗体质粒蛋白A外源蛋白B质粒蛋白A外源蛋白B固相支持滤膜抗A抗体发光，底片曝光第四十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四二、免疫沉淀检测法1.原理检测目的基因相对应的标记抗体。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

第四十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四2.优缺点其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

第四十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。

灵敏度不高,实用性差第四十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：

与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：

二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。第四十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四待测基因产物蛋白一抗二抗酶

待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶

19第四十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底第四十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗第四十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗第五十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应第五十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第五十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色第五十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）第五十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四临床检验常用的单抗第五十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四四、免疫印迹（westernblotting）法1.原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。①SDS:（SDS）：第五十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer第五十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四点样电泳方向第五十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿第五十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四DaltonSDSPAGE第六十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四④凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。

硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色第六十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四直接染色电泳结果第六十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四（2）Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白第六十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四Western装置第六十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO第六十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第六十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与

膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程ImmunoBlotting第六十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果第六十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四转译筛选法有两种:

杂交选择转译（hybridselectedtranslation,HART)

杂交抑制转译(hybridarreatedtranslation,HRT)。

转译筛选法的突出优点是将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。

第六节

转译筛选法

借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。第六十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四一、无细胞翻译系统无细胞系统cell-freesystem指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物。无细胞系统要包含以下成分：核糖体、各种tRNA、各种氨酰-tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子、GTP、ATP、20种基本的氨基酸。常见的无细胞翻译系统有：大肠杆菌无细胞翻译系统、兔网织红细胞无细胞翻译系统、麦胚无细胞翻译系统和某些肿瘤细胞制备成的无细胞翻译系统。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。第七十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四二、转译筛选mRNA无细胞翻译系统35S标记的甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体+外源DNA转录与预期的产物分子量相符？第七十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四三、杂交抑制转译法mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。单链mRNA核糖体小亚基核糖体大亚基能翻译mRNADNA核糖体小亚基核糖体大亚基不能翻译1.原理第七十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四2.过程第七十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四四、杂交释放转译法1.原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。第七十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四2.过程硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA总mRNAcDNA基因的mRNA杂交洗脱cDNA基因的mRNA体外翻译cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影cDNA编码的蛋白硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA硝酸纤维素滤膜载体和插入的cDNA收集35S标记的氨基酸第七十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记五、DNA-蛋白质相互作用筛选法第七十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四一般克隆与筛选策略第七十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四第七节

几种常用的真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）一、哺乳动物基因转移的选择标记1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK选择原理①四氢叶酸的必要性DHFR第七十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

第七十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四④胸苷酸激酶的补救作用TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk③次黄嘌呤的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP

dATP

TTP

dCTP

次黄嘌呤

补救

氨甲喋啉

抑制

抑制

第八十页，共九十九页，编辑于2023年，星期四①HAT培养基：Tk-

细胞株。TK基因。②宿主细胞③载体标记（2）TK选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入TK基因的细胞才能生存。第八十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期四20第八十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期四真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。2.二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1）

选择原理①二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸第八十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期四DHFR+细胞二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存不需要补救！第八十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期四DHFR-

细胞DHFR-

细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。需要补救！不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。第八十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期四②胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤补救胸苷补救无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:第八十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期四DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。①

宿主细胞（2）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。②

无核苷酸的培养基需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！第八十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期四③

氨甲喋呤“加压”添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。DHFR+基因。④载体标记只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie无核苷酸的培养基第八十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期四是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。3.新霉素抗性基因（neor）（1）选择原理①新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种

氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。②G418（geneticin）第八十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期四③新霉素抗性基因--neor细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。G418真核细胞死亡G418存活neor真核细胞第九十页，共九十