《检验仪器分析》第10章免疫分析

1教学基本要求掌握（1）免疫分析相关仪器检测的基本原理（2）免疫分析相关仪器的基本结构（3）免疫分析相关仪器的使用与维护熟悉（1）免疫分析相关仪器的分类和特点（2）免疫分析相关仪器的性能评价（3）免疫分析相关仪器常见故障与处理了解（1）免疫分析相关仪器的发展和作用（2）免疫分析相关仪器的临床应用第一页，共74页。第十章免疫分析相关仪器第二节发光免疫分析仪2第四节时间分辨分析仪4第一节酶免疫分析仪

31第三节免疫浊度分析仪33第五节放射免疫分析仪5第二页，共74页。3前言大量免疫学分析技术被不断地创新、发明，极大地促进了临床免疫学检测项目的推陈出新和检测手段的自动化、智能化和网络化。基于各种免疫分析技术（酶免疫分析、发光免疫分析、免疫浊度分析、荧光免疫分析、放射免疫分析）的仪器也应运而生。返回目录第三页，共74页。4第一节酶免疫分析仪酶免疫分析（enzymeimmunoassay，EIA）目前临床免疫检验最常用的分析技术，具有灵敏度高，特异性强，试剂稳定，操作简单、快速且无放射性污染等优点。返回目录第四页，共74页。5一、酶免疫分析仪的分型返回目录第五页，共74页。6（一）酶免疫分析技术的分类根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为：测定对象主要是激素、药物等小分子抗原或半抗原，其测定模式为竞争抑制法，无需分离结合和游离的酶标记物。主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定技术两种方法。均相酶免疫分析法

需采用适当的方式将游离的和结合的酶标记物加以分离，可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，后者称为酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。

非均相酶免疫分析法

返回目录第六页，共74页。7双抗体夹心法反应原理示意图ELISA检测方法：双抗体夹心法，间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法第七页，共74页。8第八页，共74页。9第九页，共74页。10（二）酶免疫分析仪的类型根据固相支持物的不同而设计成的酶免疫分析仪可以分为磁微粒固相酶免疫分析仪

管式固相酶免疫分析仪微孔板固相酶免疫分析仪微粒固相酶免疫分析仪

返回目录第十页，共74页。11二、酶免疫分析仪的工作原理以临床免疫检验最常用的酶标仪为例介绍酶免疫分析仪的工作原理。返回目录第十一页，共74页。12二、工作原理返回目录第十二页，共74页。13酶免疫分析仪其实就是一台特殊的光电比色计或分光光度计，根据ELISA技术的特点而设计。二、酶免疫分析仪的工作原理返回目录第十三页，共74页。14三、酶免疫分析仪的基本结构全自动酶标仪可以将整个系统分为加样系统

温育系统软件控制系统判读系统液路动力系统洗板系统这些系统既相互独立又联系紧密。机械臂系统返回目录第十四页，共74页。15

温育箱

反应板存储器返回目录第十五页，共74页。16X-Y头架返回目录第十六页，共74页。17

样品架

50根装

50×3返回目录第十七页，共74页。18

4根独立上下吸移管返回目录第十八页，共74页。19

检

测

光

纤返回目录第十九页，共74页。20

反应板

反应板夹具返回目录第二十页，共74页。21

清洗装置返回目录第二十一页，共74页。22

供水箱

废水箱

返回目录第二十二页，共74页。23四、性能评价目前国内已经初步建立起一套酶免疫分析仪性能的评价体系。1．噪声检测2．准确度3．精密度4．灵敏度5．通道差与孔间差检测6．线性范围7．双波长评价返回目录第二十三页，共74页。24五、仪器的操作与维护与常见故障处理开

机参数设置打开酶联软件，进入主菜单，选择测量模式以及某些参数将离心好的样品，放入样品盘，选择相应的测定程序以及试剂盘。样品装载关

机卸载样品盘，清洗管路后关闭仪器接通接线板电源，打开酶标仪器开关，仪器开始自检，自动预热2~3分钟。结果测定结束后，保存测定结果，并用外置打印机打印结果样本测定检查无误后，按”开始”键，酶标仪对样品开始进行测试（一）操作流程图返回目录第二十四页，共74页。25（二）仪器的维护酶免疫分析仪是一种精密的光学仪器，良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。返回目录第二十五页，共74页。26安装要求①仪器放置在无强磁场和干扰电压且噪音低于40分贝②操作环境空气清洁，温、湿度适宜③避免阳光直射，以延缓光学部件的老化④操作时电压应保持稳定⑤保持工作台面干燥、干净、水平，有足够操作空间返回目录第二十六页，共74页。27日常维护①仪器外部的清洁②检查加样系统③清洁仪器内部④每日仪器工作结束后的维护⑤处理废弃物返回目录第二十七页，共74页。28月维护①使用仪器厂商提供的软件执行检查程序，并打印检查结果报告归档；②检查所有管路及电源线是否有磨损及破裂;③检查样品注射器及与之相连探针是否有泄露及破损;④检查微孔探测器是否有堵塞物;⑤检查支撑机械臂的轨道是否牢固，并检查机械臂及其轨道上是否有灰尘。返回目录第二十八页，共74页。29（三）常见故障处理1．洗板头堵塞此故障在该分析仪最为常见2．加样注射器和硅胶管连接处漏水或脱落3．开机自检时报试剂盘错误返回目录第二十九页，共74页。30第二节发光免疫分析仪发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，以检测抗原或抗体的方法。既具有免疫反应的特异性，更兼有发光反应的高敏感性，在免疫学检验中应用日趋广泛。返回目录第三十页，共74页。31一、发光免疫分析仪的分型及特点在常温下，某些特定的化学反应产生的能量使其产物或反应中间态分子激发，形成电子激发态分子；当其衰退至基态时，释放出的化学能量以可见光的形式发射，我们把这种现象称为化学发光（chemiluminescence，CL）

化学发光免疫根据标记物的不同，有化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、微粒子化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和生物发光免疫分析等分析方法。现临床以前三者较为常用。返回目录第三十一页，共74页。32发光免疫分析的基本种类及常用标记物种类常用标记物化学发光免疫分析氨基酰肼类及其衍生物，如5-氢基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)等电化学发光免疫分析三联吡啶钌微粒子化学发光免疫分析二氧乙烷磷酸酯（金刚烷）等化学发光酶免疫分析辣根过氧化物酶生物发光免疫分析荧光素返回目录第三十二页，共74页。33（二）常用的发光免疫分析仪的特点全自动化学发光免疫分析仪采用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合，是一个全自动、随机存取、软件控制的智能分析系统。（雅培）全自动微粒子化学发光免疫分析仪

采用微粒子化学发光技术对人体内的微量成分以及药物浓度进行定量测定。（贝克曼）全自动电化学发光免疫分析仪磁性微珠包被采用“链酶亲和素-生物素”新型固相包被技术，使检测的灵敏度更高，线性范围更宽，反应时间更短。（罗氏）返回目录第三十三页，共74页。34二、发光免疫分析的工作原理（一）全自动化学发光免疫分析仪这种免疫分析技术又称为微量倍增技术，包括：①竞争法：多用于测定小分子抗原物质。②夹心法：多用于测定大分子的抗原物质。返回目录第三十四页，共74页。35（二）全自动微粒子化学发光免疫分析仪应用经典的免疫学原理，小分子物质采用竞争法或抗体捕获法进行测定，而大分子物质采用夹心法。返回目录金刚烷第三十五页，共74页。36（三）全自动电化学发光免疫分析仪该类分析仪综合应用了免疫学、链酶亲合素生物素包被技术及电化学发光标记技术，按照免疫学方法的原理可应用三种抗原抗体反应方法：

检测小分子量蛋白抗原抑制免疫法夹心免疫法桥联免疫法检测抗体如IgG、IgM检测大分子量物质返回目录第三十六页，共74页。37

三联吡啶钌标记的ECLIA反应原理（夹心法）

返回目录第三十七页，共74页。38三、发光免疫分析的基本结构全自动化学发光免疫分析仪

主机微机仪器的运行反应测定部分，包括原材料配备部分、液路部分、机械传动部分、光路检测部分。

仪器的核心部分，是指挥控制中心。其功能有程控操作、自动监测、指示判断、数据处理、故障诊断等，并配有光盘。

返回目录第三十八页，共74页。39电子系统流体系统分析系统主探针系统

传送舱

微电脑控制

全自动微粒子化学发光免疫分析仪

三、发光免疫分析的基本结构返回目录第三十九页，共74页。40全自动电化学发光免疫分析仪

三、发光免疫分析的基本结构就是一台完整的计算机，并配有支架及打印系统。是检测系统的核心，主要包括预清洗区、测量区、试剂区、耗品区。

主要由条形码阅读器、标本舱位、标本架转盘、模块轨道等组成。控制单元核心单元

分析模块返回目录第四十页，共74页。41四、性能评价目前应用于临床检验的发光免疫分析仪有很多种类，具有检测速度快、精度好、重复性高、条码识别系统、24小时待机、系统稳定等特点。返回目录第四十一页，共74页。42四、性能评价项目全自动化学发光免疫分析仪全自动微粒子化学发光免疫分析仪全自动电化学发光免疫分析仪测定速度60~180个/h>100个/h>80个/h最小检测量10-15g/ml≥10-15g/ml≥10-15g/ml重复性CV≤3%CV≤3%CV≤3%样品盘60个标本60个标本75或30个标本试剂盘13种试剂24种试剂18或25种试剂急诊标本均可随到随做，无需中断运行返回目录第四十二页，共74页。43五、仪器的使用与维护及常见故障的处理开

机参数设置进入菜单，设定测量参数，放置检测试剂和消耗品将被测样品放入样品架，输入起始样品栏的位置和起始样品编号，选择样品的测试项目样品装载关

机取出试剂放入冰箱，清理废弃物，清洗探针后，关闭仪器打开仪器电源，等待仪器自检，按“STARTUP”键启动结果测定结束后，可以选择需要浏览的结果，打印报告样本测定按已设定的参数和程序，按“Run”键仪器自动检测全自动化学发光免疫分析仪返回目录第四十三页，共74页。44五、操作与维护及常见故障处理开

机工作前准备在主屏幕进行系统设置后，装入各类耗材，并按要求进行质控和定标将样本装入标本架，在试验菜单下输入标本架号、标本号以及检测项目样品装载关

机卸载标本，清理废弃物，清洗管路后，让仪器处于24h待机状态打开仪器主电源和显示器，开机仪器进行初始化结果测定结果可自动打印，也可以在菜单下选择浏览结果，以标准模式发送结果样本测定确认标本装载无误后，开始测定操作，仪器会自动检查耗材和校准状态全自动微粒子化学发光免疫分析仪返回目录第四十四页，共74页。45五、操作与维护及常见故障处理开

机设置仪器参数，装载各种耗材，运行校准程序，再运行质控和定标将样本装入标本架，选择标本类型，输入标本架号、标本号以及检测项目样品装载关

机卸载标本，清理废弃物，清洗管路后，关闭主电源，关闭供水系统打开供水系统和操作电源，开启启动程序，输入操作者ID，进入软件，启动系统操作结果可以在仪器上选择浏览结果，也可以打印检测报告，以标准模式发送结果样本测定确认启动条件后，按“Start”键，仪器会自动对标本进行测定全自动电化学发光免疫分析仪工作前准备返回目录第四十五页，共74页。46（二）仪器的维护1．日保养保持机器外壳干净。检查系统基本状态，之后再按保养程序进入清洗系统进行清洗针。2．周保养检查主探针上、下导轨，进行特殊清洗。每周保养后一定要做系统检测。3．月保养每月用专用不锈钢小刷刷洗1次主探针、标本采样针、试剂针的内部。生理盐水反复冲洗针内部，针外部用酒精擦拭干净，然后上好针。返回目录第四十六页，共74页。47（三）常见故障处理全自动的发光分析仪一般都具备很好自我诊断功能，一旦有故障发生时，仪器一般都能自动检测到，显示错误信息并伴有报警声。1．压力表指示为零2．真空压力不足3．发光体错误4．轨道错误返回目录第四十七页，共74页。48第三节免疫浊度分析仪免疫浊度技术将现代光学仪器与自动分析检测系统相结合应用于免疫沉淀反应，可对各种液体介质中的微量抗原、抗体、药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。返回目录第四十八页，共74页。49一、免疫浊度分析仪的分型（一）免疫浊度技术的分类根据检测原理的不同，免疫浊度技术分为透射光免疫浊度法（turbidimetricimmunoassay）和散射光免疫浊度法（nephelometryimmunoassay）。返回目录第四十九页，共74页。50一、免疫浊度分析仪的分型（二）免疫浊度仪的种类ARRAY特种蛋白分析仪

DBl00特种蛋白分析仪

BNProspec特种蛋白免疫分析仪

IMMAGE免疫浊度分析仪

返回目录第五十页，共74页。51二、免疫浊度分析仪的工作原理常用免疫浊度仪检测原理基本都是速率散射浊度法，所谓速率是指在抗原-抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。在抗体过量的前提下，悬浮于缓冲液中的抗原-抗体免疫复合物颗粒通过光束时产生的散射光速率变化，散射测浊仪在抗原与抗体反应的最高峰测定其复合物形成的量，该信号的强弱与抗原浓度成正比，速率峰值经微电脑处理转换成抗原浓度返回目录第五十一页，共74页。52三、免疫浊度分析仪的基本结构ARRAY特种蛋白分析仪一般由分析仪、计算机、打印机三部分组成。分析仪是系统的主要部分，包括散射测浊仪、加液系统、试剂和样品转盘、卡片阅读器、软盘驱动器等。返回目录第五十二页，共74页。53四、性能评价特种蛋白分析仪通常采用红色激光，散射比浊原理测定单个样本中的特定蛋白含量。操作简便，无需做定标曲线，仪器能自动做空白对照。1．精密度2．正确度3．线性范围4．测定速度5．检测标本类型返回目录第五十三页，共74页。54五、仪器的操作与维护及常见故障处理开

机进入主菜单，进行光源校正，检查所有试剂，缓冲液等量是否足够，查看废液是否满将被测样品放入样品架，输入杯号和项目组合号或单选所需项目样品装载关

机清理转盘，清洗仪器后，先关上主机电源开关，再依序关上显示屏和打印机开关先打开显示屏和打印机电源，最后打开主机电源开关，仪器自检后进入待机状态结果测定结束后，可以选择需要浏览的结果，打印报告样本测定按已设定的参数和程序，按“Start”键仪器自动检测（一）操作流程图工作前准备返回目录第五十四页，共74页。55（二）仪器的维护良好的保养可以延长机器的使用寿命并减少故障的发生，因此检验工作者应严格按照操作手册定期对仪器做以下的保养。日保养每两个月一次的保养周保养每六个月一次的保养返回目录第五十五页，共74页。56（三）常见故障处理1．机械传动问题2．流动池液体外流故障3．工作中突然死机4．中文信息处理系统无检测信号返回目录第五十六页，共74页。57第四节时间分辨分析仪近年来，时间分辨荧光免疫分析（time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TRFIA）作为一种新型的非放射性免疫标记技术，具有灵敏度高、线性范围宽、应用范围广等优点。返回目录第五十七页，共74页。58一、时间分辨分析仪的分型及特点TRFIA可以分为均相和非均相两种类型。均相

TRFIA省去了洗涤、分离和加增强液等烦琐的步骤，具有快速、方便等优点，但不足之处是需要特殊螯合剂。

非均相

TRFIA目前广泛应用于临床，又可以分为好几种测量方法。12返回目录第五十八页，共74页。59一、时间分辨分析仪的分型及特点协同荧光测量法

直接荧光测量法

固相荧光测量法

解离增强测量法

非均相TRFIA

返回目录第五十九页，共74页。60二、时间分辨分析仪的检测原理与基本结构用镧系三价稀土离子及其螯合物作为示踪物标记抗原、抗体、核酸探针等物质，反应后，将结合部分与游离部分分开，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、Stokes位移大、荧光半衰期长），待背景荧光信号降低到零以后，再进行测定，此时所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。根据荧光强度判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。（一）检测原理返回目录第六十页，共74页。61（一）检测原理正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，可使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。返回目录第六十一页，共74页。62（二）基本结构DELFIA为台式仪器，由样品处理系统、实验运行系统、检测系统和电脑数据处理系统四部分组成。返回目录第六十二页，共74页。63三、性能评价时间分辨荧光免疫分析仪具有灵敏度高、特异性高、线性范围宽、标准曲线稳定性好、试剂有效期长和易于自动化等优点，是临床医学实验室理想的免疫分析仪之一。此外，时间分辨荧光免疫检测动态范围宽，可达4~5个数量级；标记物制备简单，稳定性好，有效使用时间长，多数可达6个月；标记蛋白时反应条件温和，免疫活性很少受损；测量快速。返回目录第六十三页，共74页。64四、仪器的使用与维护及常见故障处理开

机检查试剂和耗材是否到位，选择测试模式，设置系统参数，进行校准、定标和质控样品放入样品架，并放到装载位置，创建工作表，编辑试管架图，输入样品ID和测试项目样品装载关

机处理废弃物，清洗管路，关闭电脑电源，关闭微孔板处理器和样品处理器电源依次打开样品处理器电源、微孔板处理器电源、计算机电源，运行系统软件结果测定结果被保存在指定的文件夹中，可以在屏幕浏览结果并发送报告，并打印结果。样本测定按开始键，仪器显示试剂架各试剂和消耗品的情况，检查无误后，点击“OK”。（一）操作流程图工作前准备返回目录第六十四页，共74页。65（二）仪器的维护时间分辨荧光免疫分析仪所在实验室需要适宜的温湿度，实验室应注意清洁，防止灰尘。我们对仪器的维护工作包括：1．每日维护2．每周维护3．每月维护返回目录第六十五页，共74页。66（三）常见故障处理故障现象原因分析处理方法仪器自检不通过，或在开始实验时提示错误，实验无法继续（1）左侧增强液瓶未拧紧或无增强液或仪器的流量传感器漂移。（2）测量部件滤光片灰尘较多，仪器本底过高。（3）试剂传送器或微孔板传送器的传感器有灰尘或故障。（1）重新拧紧增强液瓶。对仪器的流量传感器漂移问题应联系维修工程师（2）打开仪器盖子，用擦镜头纸擦拭干净。（3）用酒精棉球擦拭相应传感器和滑轨，然后用润滑油擦拭滑轨，重新引导系统。不能正常加样，实验停止（1）试剂液体量不足，可能由于缓冲液（或标记抗体）不够。（2）试剂液体量过多，可能由于缓冲液（或标记抗体）过多。（3）实验中缓冲液（或标记抗体）中气泡过多，加样头遇到气泡由于全自动仪器需要一定的保底量，在实验前应确保有足够的液体，但也要注意不要超过一瓶未用过试剂相应的量，需要溶解的试剂应提前一天配制，配制时将气泡吸去。部分吸头无法取到吸头是清洗后重