RNAi-2006诺贝尔生理学奖或医学奖

内容摘要一、获奖者简介二、RNAi现象的发现三、RNAi现象的分子机理四、RNAi的应用第一页，共22页。一、获奖者简介安德鲁·法尔(AndrewZ.Fire），美国科学家、生物医学家。1959年出生于美国，1983年获美国麻省理工学院生物学博士学位，现任斯坦福医学院病理学和遗传学教授。主要研究方向为细胞和组织对遗传改变的反应机制。

克雷格·梅洛（CraigC.Mello),1960年出生，1990年获得哈佛大学生物学博士学位，现任美国马萨诸塞州大学医学院分子医学教授。主要研究方向是胚胎发生早期细胞进行分化的机制。现在Mello实验室的研究方向为RNAi和胚胎发育。第二页，共22页。诺贝尔奖评审委员会的公报中称：“他们的发现澄清了许多令人迷惑和矛盾的试验结果。揭开了大自然控制遗传信息传递的一种基本机制，他们开创了一个崭新的研究领域。”法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息提供了基础性的依据。公报指出，RNAi已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。第三页，共22页。二、RNAi现象的发现1、1990年，为加深矮牵牛花(penmias)的紫色，Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因。可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。2、1992年，Romano和Macino在脉孢霉进行转基因研究时,发现了存在于真菌中的类似现象，他们称之为基因抑制(quelling)。这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。3、1995年，康奈尔大学的SuGuo在用反义RNA(antisense

RNA)阻断秀丽隐杆线虫基因表达的试验中发现，反义RNA和正义RNA(senseRNA)都阻断了基因的表达，都具有很高的基因沉默活性。当时他们对这个结果感到十分困惑。RNAi发现历史第四页，共22页。4、1998年，AndrewFire和CraigC.Mello等的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA,同时包含了正义链和反义链的双链RNA(double—strandedRNA，dsRNA)阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义链强得多。Fire和Mello把他们的结果发表在1998年2月19日的《Nature》杂志上，他们的发现澄清了此前一系列令人们感到困惑的实验现象，并且揭示出了一种遗传信息流动的控制机制。．带有肌肉蛋白编码信息的RNA被注射到秀丽隐杆线虫体内．单链RNA没有产生任何效果．但当双链RNA注射之后，线虫开始抽搐，这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷型基因的线虫所表现出的表型．第五页，共22页。第六页，共22页。第七页，共22页。三、RNAi现象分子机理1、基本概念：RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double-standedRNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。第八页，共22页。2、分子机理：在RNAi起始阶段，长链dsRNA结合到一个特异的内切酶Dicer上，并被Dicer切割成21-23nt小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。然后，另外一种蛋白复合物RISC(RNAInducingSilencingComplex，包含了双链RNA解旋所必需的蛋白)与这些siRNA结合在一起。siRNA分子的一条链被去掉，但另外一条链结合在RISC复合物上作为一个探针去识别mRNA分子。当一个mRNA分子可以和RISC复合物上的RNA片段配对时，它就结合到复合物上,在距离3'端12个碱基处切割靶向mRNA,从而引起转录后基因沉默。第九页，共22页。FirststepdsRNAisdigestedinto21-23siRNAsbyDicer(MemberofRNaseIIIfamily)Secondstep:siRNAsbindtoRISC(RNAInducingSilencingComplex)ActiveRISCTargetshomologoustranscriptCleavesthem12ntfrom3’endofsiRNAMechanismofcleavage:unclearRISCcomposition:singlesiRNA,RNaseThirdstep:

第十页，共22页。3、该技术有3个重要特点：第一，它具有高效性。从刚开始的21~23个核苷酸小干扰RNA分子，到后来研究应用的小发夹RNA分子，都具有高效抑制作用，抑制率在90%以上；第二，有严格的序列特异性针对变异基因设计的RNA分子抑制异常基因，而正常基因不受影响；第三，具有高度的稳定性。化学性质很稳定，不需要修饰。第十一页，共22页。四、RNAi的应用1、RNAi是抵抗病毒、保持基因组稳定性、抑制跳跃基因的防御系统

跳跃基因也叫转座子，是一些在基因组中可以移动的DNA序列。它们存在于所有的生物体内，如果他们移动至错误的地方就会给机体造成损伤。很多转座子复制它们的DNA到RNA，然后再反转录回DNA，插入到基因组中的另外一个位置。这些RNA分子有一部分是双链的，可以被RNAi所控制。RNAi体系在脊椎动物的免疫系统中起重要作用：它识别入侵的寄生物dsRNA，激发初始反应，然后扩大此效应以排出异物。因此，RNAi可保护基因组免受转座子的侵害。第十二页，共22页。2、RNAi是调节基因表达的一种机制

在人类和线虫的细胞中RNAi可以用于调节基因的表达。人体基因组中有数百个基因编码被称为microRNA的小RNA分子。它们含有其他基因的部分密码。这样的microRNA可以形成双链RNA结构并激活RNA机制阻止蛋白质合成，使那一特定基因的表达沉默。由此，microRNA的遗传调节在生物有机体的发育及细胞功能的控制中起重要作用。第十三页，共22页。3、RNAi是基因组功能研究的有力工具

利用RNAi使靶基因沉默在单个基因功能研究中已经得巨大成功。其主要原理是：RNAi主要通过在转录后水平阻断基因的表达，使特定基因的mRNA破坏，导致蛋白质无法合成，出现“基因沉默”。这样，通过关闭基因的表达，当某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的体现出来了。第十四页，共22页。4、RNAi可能是将来基因治疗的新途径RNAi技术是一项快速高效的序列特异性基因剔除技术，在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”。针对一些对人类健康严重危害的核酸病毒，如SARS病毒、肝炎病毒、艾滋病病毒等，通过RNAi的方法设计核酸药物就比较方便。

eg：哈佛大学血液研究中心通过RNAi技术使细胞凋亡相关蛋白质Fa8受体沉默，成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝纤维化。试验结果发现未接受RNAi治疗的小鼠有40％在3d内死亡，而40只接受RNAi治疗的小鼠有33只活了下来，10d后研究人员检查这些小鼠的肝脏，发现完全正常。第十五页，共22页。1.siRNA的一般结构：哺乳动物：21-23bpdsRNA

其它生物：更长的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的设计第十六页，共22页。2.设计流程（选择siRNA靶位点）从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据5‘和3’非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内）等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编码序列同源的靶序列。设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸顺序并经同源序列比较确证而得。siRNA的设计第十七页，共22页。化学合成体外转录（载体/反应体系）转录载体体内转录siRNA的合成第十八页，共22页。通过有效的体外转录合成SiRNA一次反应产物足够几百次常规转化每个siRNA只需用户合成2条脱盐处理的寡核苷酸DNA（其中8个碱基与T7启动子引物的5’端互补，onlinetool：/techlib/misc/silencer_siRNA_template.html）包括内参模板验证转录反应效率SilencersiRNAConstructionKit

第十九页，共22页。用U6PolIII，在哺乳动物细胞中合成siRNA，无需另外合成寡核苷酸。可和其他带选择性标记的质粒共转染保证稳定表达siRNAsiRNA合成质粒－pSilencer1.0-U6

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