基因的转移的课件资料

基因的转移的课件资料第1页/共61页2第一节基因转移的概念第二节宿主细胞与条件第三节重组体导入原核细胞一、转化二、受体细胞三、感受态大肠杆菌的制备四、转化：重组DNA导入大肠杆菌内容提要第2页/共61页3第一节基因转移的方法定义：基因转移是重组DNA导入受体细胞的过程。一、基因转移的方法转化作用转导作用转染作用接合作用第3页/共61页41.接合作用conjugation当细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细菌细胞转移至另一细菌细胞，这种类型的DNA转移作用。如F质粒(F因子)的接合作用。第4页/共61页5图F质粒(F因子)接合作用

第5页/共61页62.转化作用

transformation定义*：受体细胞通过一些方法处理，接受外源DNA而获得新的遗传表型。将外源DNA导入细菌、酵母和植物细胞的过程。由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变。受体细胞经过处理后，就容易接受外源DNA的感受态细胞。第6页/共61页7图转化作用第7页/共61页83.转导作用

transduction（1）定义通过病毒的感染作用，将外源DNA导入的受体细胞的过程。（2）程序用病毒或噬菌体作载体，与目的DNA重组后，在体外用外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式，进入宿主细菌或细胞，使目的DNA得以复制繁殖。第8页/共61页9体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106噬菌斑。当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及重组。第9页/共61页10图转导作用第10页/共61页11①体外包装invitropackaging定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。（3）体外包装的噬菌体的转导第11页/共61页12②体外包装的方法与过程

第12页/共61页13③转导

通过受体大肠杆菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，将带有外源基因的重组体注入受体菌进行扩增。第13页/共61页144.转染transfection将外源DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞。方法：CaCl2法处理宿主菌成感受态，重组噬菌体DNA进入感受态细菌，进行复制和繁殖。采用人工脂质体包裹病毒DNA，再与受体细胞膜融合，而将DNA导入宿主细胞。病毒的感染与转染相区别！第14页/共61页15二、基因转移的目的为什么要将重组体导入受体细胞？1.大量扩增重组DNA重组DNA量少，只有导入受体细胞，经多次细胞分裂，可大量扩增重组体。2.防止DNA降解获得的重组DNA，必须立即导入宿主细胞，否则非常容易降解。3.纯化和筛选重组DNA区分重组体和非重组体。被转化的宿主中，含有多种形式DNA，必须筛选真正重组体。第15页/共61页16第二节受体/宿主细胞一、种类细菌E.coli酵母高等动物细胞植物细胞第16页/共61页17二、受体细胞必须符合的条件１.对重组DNA的复制和扩增没有严格的限制２.不存在特异的内切酶体系，降解外源DNA；３.在重组DNA增殖过程中，不会被修饰；４.重组缺陷型，不会产生体内重组；５.容易导入重组DNA；６.符合重组DNA操作的安全标准。第17页/共61页18三、E.coli受体细胞1.特性用于转化的E.coli细胞的特点（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株（Rˉ，Mˉ），（2）允许外源DNA进入E.coli体内，并稳定地遗传给后代。第18页/共61页192.受体菌的条件与选择符合生物安全性的要求。宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。宿主菌处于感受态。转化率。3.常用E.coli菌株DH5α、DH10BJM101~JM109其它第19页/共61页20图常用E.coli菌株第20页/共61页21第21页/共61页22第三节重组体导入原核细胞一、一般概念1.转化transformation将重组DNA或外源基因导入宿主细胞（菌株）的过程。2.转化子Transformant将经过转化后的细胞，在选择培养基中培养，筛选出的带有重组DNA的受体细胞（菌株）。第22页/共61页233.转化率（1）定义每gDNA可转化的受体细胞（细菌克隆）数。（2）计算转化细胞数/gDNA。如1ngpBR322产生104个转化子，吸收的DNA分子只占总DNA的0.1%，转化效率不高。第23页/共61页24（3）转化率的计算统计每个培养皿中的菌落数。转化子：即转化后在含抗生素的平板上长出的菌落。根据此培养皿中的菌落数，可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率＝转化子数／每mg质粒DNA

或转化子总数／加入质粒DNA量mg第24页/共61页25感受态细胞总数＝对照组菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数第25页/共61页26

转化大肠杆菌的方法有2类：1.感受态细胞法将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容易接受外源DNA。2.电击法（电转化法）利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打“洞”，让外源DNA进入细胞内。二、转化的方法第26页/共61页27（一）基本概念由于质粒载体缺失了mob基因，不能自行接合转移，必须改变E.coli质膜的通透性。1.感受态*Compenent受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸收外源DNA的生理状态。2.感受态细胞Compenentcells经物理和化学方法处理，受体细胞膜的通透性改变，允许外源DNA进入。三感受态细胞的制备第27页/共61页283.感受态假说cacl2溶液制备感受态细胞的机制假说1细菌的细胞壁局部溶解，质膜穿孔，让外源DNA进入。假说2细胞处于感受态时，表面形成一种可接受DNA的酶位点，一旦细胞制备成感受态细胞，就能稳定地摄取外源DNA分子。第28页/共61页291.CaCl2的作用改变细菌质膜通透性，允许DNA进入。2.操作程序挑单菌落置培养基中。过夜培养，至OD600=0.3~0.5。冰浴10min。4℃离心，去培养液。冰冷的0.1molCaCl2悬浮菌体。冰浴10min

。4℃离心，去培养液。冰冷的0.1molCaCl2重悬浮菌体。分装，-70℃冻存。（二）CaCl2制备感受态大肠杆菌第29页/共61页303.CaCl2法的优点①方法简便，使用广泛。②转化效率高，106~108/gDNA。可满足一般实验的要求。③制备的感受态E.coli，可于-70℃保存半年（无菌甘油占总体积的15％）。第30页/共61页31图制备感受态E.coli的过程*培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice10min4℃离心收集菌用冰冷的CaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装，-70℃冻存用冰冷的CaCl2重悬Onice30min冰冷CaCl2重悬第31页/共61页32（三）转化：热休克法heatshock1.转化方法与过程感受态细菌加入重组质粒，置冰浴中混匀。42℃，热休克。细菌摄入重组质粒。加入LB培养基，37℃培养。转化液接种到含抗菌素的平板倒置培养，

37℃过夜。第32页/共61页33图热休克法heatshock10ng重组DNA100L感受态菌冰上混合。静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃震摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA第33页/共61页34图细菌的平板培养第34页/共61页35（四）影响转化率的因素1.重组质粒的质量和浓度①用于转化的重组质粒应是cccDNA。1ng的cccDNA可使50μl的感受态细胞达到饱和。②转化效率与DNA浓度在一定范围内成正比。DNA过多，转化效率降低。③DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。第35页/共61页362.感受态细胞的生长状态和密度①生长状态细菌生长密度达到对数生长期为好。②密度过高或不足均会影响转化效率。DH5α菌的OD600=0.5时，细胞密度在5×107

株/ml菌液时，较合适。第36页/共61页372.感受态细胞的生长状态和密度③CaCl2处理要充分使细菌细胞膜失去一些蛋白。④感受态菌要储存在-70℃以下。感受态菌融化必须迅速。融化后的感受态菌不能再次冻存使用。多次转接的菌不可用。第37页/共61页383.试剂的质量要高所用的试剂纯度高，用AR或GR。用超纯水配制。使用试剂分装保存。第38页/共61页394.无菌操作，防止污染在转化过程中，防止DNA酶、杂菌和杂DNA的污染，否则实验失败。在无菌条件下操作。所用新的离心管、tip头等，并经高压灭菌。所用试剂要灭菌。第39页/共61页40第四节外源基因导入酵母细胞一、酵母菌株的选择转化率高的酵母菌。突变酵母菌株（与导入的载体基因互补）。不育的酵母菌株（不会与其他酵母接合）。常用的酵母菌：ura3-52、trp1-289、leu2、leu3、his3等。第40页/共61页41酵母的克隆和表达载体有4种类型：YIP（整合型质粒）YRP（复制型质粒）YEP（附加体质粒）YCP（着丝点质粒）。其中，YEP附加体类质粒，含有2um质粒，是构建酵母表达质粒载体中最常用的。二、酵母细胞的载体第41页/共61页42三、LiCl转化法1.LiCl利用Li+盐，使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。2.PEG（聚乙二醇）利用PEG，使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。3.转化的过程下图。第42页/共61页43

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源DNA的酵母载体感受态40%PEG4000第43页/共61页44四、原生质体转化法原生质*：去除细胞壁后的酵母结构。PEG（聚乙二醇）：使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2：使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。第44页/共61页45图原生质体转化法

酵母菌原生质体感受态酶去壁CaCl2

PEG插入外源DNA的酵母载体转化第45页/共61页46第五节外源基因导入动物细胞一、转染transfection1.定义*动物基因的转移感染作用，将DNA或RNA转送进入活体细胞中。第46页/共61页472.转染的技术或方法常用的转染方法有6种。（1）磷酸钙（calciumphosphate）主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然后吞噬。（2）二乙氨乙基-葡聚糖（DEAE-dextran）主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然后吞噬。（3）脂质体（liposome）主要机制：DNA带负电之磷酸根会与脂小体表面之正电荷结合，脂小体带正电荷的部分又会与细胞表面带负电荷的唾液酸结合，藉以进行转染。第47页/共61页48（4）电穿孔（electroporation）主要机制：电流方式进行。（5）显微注射（microinjection）主要机制：在下显微镜，以微细针管穿刺细胞将DNA射入。（6）病毒感染（retrovirusinfection）主要机制：利用多种不同的病毒特性，将DNA改造成病毒的一部份，另外病毒本身有害基因也加以改造，再藉病毒感染方式送入基因。第48页/共61页49二、磷酸钙共沉淀法形成含磷酸钙和DNA的沉淀。程序：将DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀。DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内。细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞。再继续培养筛选转化株。该法不需要载体。不同细胞吸收DNA沉淀的能力不同。最多10%。第49页/共61页50图磷酸钙沉淀法第50页/共61页51三、二乙氨乙基-葡聚糖法二乙氨乙基（DEAE）—葡聚糖（dextran）能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。第51页/共61页52DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-dextran外源DNA细胞混合摄入第52页/共61页53四、脂质体法lipofectin脂质体：人工合成的磷脂。定义：将外源DNA用人工磷脂包埋，导入淋巴细胞和HeLa细胞。程序：将待转化的DNA与人工磷脂混合，在表面活性剂的存在下，磷脂形成包埋水相DNA的脂质体结构。将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。第53页/共61页54图脂质体法lipofe