漆酶在环境生物治理中的应用

关于漆酶在环境生物治理中的应用第一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二引言一般的环境生物治理技术，都是直接利用微生物进行污染物的处理。与直接利用微生物处理废水相比,酶制剂催化反应具有以下优点：分解效率高毒性小,易操作。微生物常常具有致病性，而酶对环境很友好，因为酶及其反应产物在环境中极易进一步被生物降解。使用范围宽，酶可以在较宽的pH,温度及盐浓度范围内处理低浓度或较高浓度的污染物。而微生物一般仅适用于处理较低浓度的污染物。第二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二引言酶制剂的主要缺点是价格高，且易受各种因素（如盐的浓度，pH及有机溶剂等)的干扰变性失活。但随着现代生物技术的发展,通过有效地分离、纯化、基因表达与重组技术。生产大量的、便宜的酶已成为可能。通过使用新型的酶固定化技术，可明显提高酶的使用稳定性和重复利用率，从而可进一步降低其使用成本。第三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶漆酶(EC1.10.3.2),对-二酚:(双)氧氧化还原酶,又名酚酶、多酚氧化酶、漆酚氧化酶等,是一种含铜的糖蛋白氧化酶,是多铜氧化酶的一种[1]，属于氧化酶的蓝铜家族。对漆酶的研究已有100多年的历史,是有记载以来开发最早的酶之一。1883年,日本人Yoshida在研究漆树的生漆漆液成分时发现这种酶成分,但当时他误为淀粉酶物质。漆酶也因此得名。

1898年,法国人Bertrand在研究越南产漆液的时候,首次提出了漆酶(laccase)的概念并沿用至今[2]。第四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶来源在自然界中,漆酶分布于多种植物、几乎所有的真菌体内,以及少数昆虫和细菌中。它们可以是分泌的酶，也可以定位在细胞内，因物种而异。用于工业实践和科学研究的漆酶，其主要来源分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类。而真菌漆酶也历来被人们用作研究漆酶的模式物。第六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶来源分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门(Basidiomycotina)、子囊菌亚门(Ascomycotina)及半知菌亚门(Deuteromycotina)等高等真菌,其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌[3]。漆酶皆为糖蛋白,其含糖量和种类因来源不同而有所不同。一部分菌株的漆酶由数种同工酶组成,多为单体酶,该酶具有广泛的底物专一性。第七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶的性质1漆酶的分子特征漆酶是一种糖蛋白,肽链一般由500个左右氨基酸组成,糖配基占整个分子的10%～45%。糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异,漆酶的分子量随来源不同会有很大差异,甚至来源相同的漆酶分子量也会不同[4]

。第八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶的性质2漆酶的生化特性漆酶能催化许多化合物的氧化反应,底物比较广泛,包括许多与对二酚结构类似的化合物,如氨基苯酚,邻、对苯二酚,多酚,多胺,木质素和芳基二胺等。一些漆酶能高效地氧化抗坏血酸,另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。必须注意的是过氧化物酶和其他一些多酚氧化酶也可以催化类似的反应,但这些酶不会利用分子氧作为第二底物,因此测定催化反应中氧吸收速率可以作为漆酶活性的可靠证据。漆酶的抑制剂大多是铜离子螯合剂,有卤化物、半胱氨酸、EDTA和SDS

等,离子强度的不同也会影响酶的活力。第九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶的催化机制

漆酶合适的底物分子是酚类，以及芳香性和脂肪性的胺类。它们催化的过程是底物的单电子氧化，生成相应的活性自由基。酶分子中含有4个铜原子构成的簇作为催化核心（图a），实施氧化还原过程。在催化核心中铜原子的相互作用引起了强烈的电子吸收，产生了典型的蓝色。第十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二

图b为漆酶催化的循环过程，1分子的氧被还原为2分子的水同时4个底物分子氧化产生4个自由基，这些活性的中间物随后转变为二聚体、寡聚体和高聚物。第十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二

漆酶催化的反应可以因为其他分子存在与否而分为3种不同的模式，见上图。最简单的模式是，只有一种底物分子，并不存在其它分子，如图a

所示。在这样的情况下，酶直接催化底物的氧化，完成整个反应。第二种情况是，在酶和底物中存在着一个中介分子，通过中介分子的氧化还原过程，进行电子的传递，见图b。这种情况更常见，因为有时需要氧化的分子太大，无法与酶活性中心—铜簇接近，此时需要中介分子，或者因为底物分子的氧化还原电位太高，反应不能一次完成，此时也需要中介分子的帮助。图c所示的情况最复杂，在这种模式中，除了有中介分子外，还需含有黄素作为辅基的脱氢酶介导电子的传递。

第十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二生产[5]菌种的筛选及选育培养方式培养基培养条件目前研究最多的是液体培养,但也有采用固体培养的报道。这两种不同的培养方式对菌体生长和漆酶酶活的影响,现在还不是很清楚。在液体培养中,对基础培养基进行优化时,大多根据碳源、氮源、C/N比、无机盐和微量元素对漆酶酶活的影响进行选择;另外在培养基中加入某些天然物质,配成半合成培养基对提高漆酶的产量也非常有利。在确定合适的培养基后,还要考察环境条件对菌体产漆酶的影响。需考虑的因素有菌龄、装液量、接种量、培养温度、培养时间、初始pH值、摇床转速及培养液黏度等。不同的菌种对这些条件的要求也不同。第十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二分离纯化漆酶分离纯化时,一般先用快速定性滤纸过滤最优发酵条件下的发酵液,获得粗酶液,然后利用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等方法对粗酶液进行处理;再用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等方法进一步分离提纯,必要时选择区带电泳和等电聚焦作为最后的提纯步骤;最后还可以通过控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH值等方法来获得漆酶晶体。第十四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二固定化通过使用新型的酶固定化技术，可明显提高酶的使用稳定性和重复利用率，从而可进一步降低其使用成本。固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机的载体上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。其中物理方法主要有物理吸附法、包埋法和离子吸附法三种；化学方法主要有共价结合法和交联结合法两种。第十五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二固定化方法第十六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二真菌漆酶的固定化[6]第十七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二降解废水中的氯酚类有机化合物

氯酚类物质是一类非常重要的工业有机化合物，被广泛应用于许多商品如染料、颜料、防腐剂、除草剂、杀虫和杀菌剂等。由于氯酚类化合物具有不同程度的毒性，因此，生产这些物质所排放的工业废物是一污染源；另外，如石油相关产业，纺织工业以及造纸工业纸浆氯漂废水以及饮用水使用氯气杀菌过程都产生一些氯酚及其衍生物，对环境和人类健康造成严重危害。辣根过氧化物酶和酪氨酸酶具有降解环境中这类有毒有害物质的能力。据报道，漆酶具有与这两种酶相似的性质,但漆酶在反应中不需要添加过氧化氢。第十八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二影响降解因素底物的转化量与底物化学结构上的取代基、取代基位置及取代基数量有关。总的来讲随着芳环上氯原子取代数目的增加，漆酶转化二氯酚、三氯酚及五氯酚的能力随之下降。但有一特殊情况，即漆酶转化4-氯酚的能力不是氯代酚中最强的，而是以转化2,4-二氯酚的能力最强。漆酶转化各酚型物质的能力依次为甲酚>甲氧基酚1氯酚>溴酚。同时，漆酶转化底物的有效性随着底物分子量的增大而下降［7］。底物的化学结构pH值

一般来讲，体系pH值对酶活性有较大影响，同时底物的化学结构也影响着最适pH值［7］。随着酚芳环上取代氯原子数目的增多，过氧化物酶的最适pH值将随之下降，pH值从4-氯酚的8.3降到二氯酚的6.5到三氯酚的6.1到五氯酚的5.4。第十九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二漆酶浓度的高低对氯酚底物的转化率有较大的影响。在任一底物DCP浓度下，底物的转化率都随着酶量的增加而增大。在相同漆酶用量下，不同底物的转化率则各不相同。底物的浓度对漆酶的活性也有一定的影响。底物和漆酶浓度添加剂反应时间和温度某些添加剂的加入对漆酶处理酚类物质有较大的促进作用。第二十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二印染废水合成染料广泛应用于印染工业,目前已超过10000种。根据染料结构的不同,可分为漆酶底物类染料和非漆酶底物类染料。蒽醌类染料是漆酶的底物,可被漆酶直接氧化,脱色和降解程度与酶活性呈正比[8]

。实验证明[9],白腐菌Trametestrogii(StrainBAFC463)分泌的漆酶和锰过氧化酶降解硝基苯和蒽醌混合物,12～24d后去除率大于90%。降解过程中漆酶的活性和稳定性远远高于锰过氧化酶,对污染物的降解起主导作用。第二十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二印染废水偶氮类和靛青类染料不是漆酶的底物,但当添加小分子介体物质ABTS

后,降解效果明显提高,提高比率与ABTS浓度呈正比[8]

。实验还证明,偶氮类和靛青类染料在漆酶作用下,降解非常缓慢,当添加(33umol)蒽醌染料后,降解速度迅速提高到35～40mg/(11h)[10],这一特点使漆酶在工业染料降解中的应用成为可能。第二十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二造纸工业造纸工序之一是纸浆漂白，传统的化学漂白法是采用氯和氯化物对纸浆漂白，含氯漂白的废液含有很多有毒的氯化有机物（如三氯甲烷、各种氯代酚、二噁英等等）。在使用化学漂白剂前用漆酶来处理，可以降解化学浆中的残余木质素,从而降低漂白所需漂剂的用量,降低废水的污染负荷,减少废水中的有毒物质,使废水容易处理。有研究者利用漆酶处理麦草化学浆，观察其降低氯漂废水污染负荷的作用[11]。要从根本上除去纸浆中残留的木素，消除有毒含氯漂白废液污染，必须利用能够直接进攻木素的三种主要氧化酶：木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。漆酶被认为是最有应用前景的酶,利用木聚糖酶和漆酶的共同作用有望完全降解掉纸浆中残留的木素,实现