木犀草素对粪肠球菌毒力因子作用机制的研究

木犀草素对粪肠球菌毒力因子作用机制的研究牙髓病和根尖周病常由细菌感染引发，当前临床上常采取根管治疗术对其进行治疗。我们国家根管治疗的技术固然已经很成熟了，但临床上结合各种因素仍存在一定的失败率。近年来许多学者以为根管内微生物的感染是造成根管治疗失败的重要原因[1—2]。有报道表示清楚，在根管治疗失败的病例中，粪肠球菌的检出率较高，说明粪肠球菌是较常见的细菌[3]。粪肠球菌经常继发于根管内而感染，是重要致病菌，它的生存能力极强。粪肠球菌的生存力较顽固，其生物被膜的存活力和致病性愈加顽强，传统的根管治疗术对构成生物被膜的根管的治愈率不高。因而对于微生物的感染造成治疗失败的研究受到广阔研究者的关注。加之如今临床上使用的消毒药物对感染粪肠球菌的根管的消毒效果欠安，以至有些消毒药物还具有一定的毒副作用，导致粪肠球菌产生耐药性，所以越来越多的研究者转向来研究毒副作用小而且不容易构成抗药性的中药。本研究的意义在于更进一步的了解木犀草素对生物被膜状态下的粪肠球菌的抑制效果并讨论其对粪肠球菌毒力因子gelE、esp、ebpA的影响的机制。1材料与方法1.1重要材料和仪器粪肠球菌标准株ATCC(广东环凯生物科技〕，木犀草素标准品〔上海金穗生物科技，产品批号20150301，HPLC98%)，脑心浸液琼脂培养基、脑心浸液肉汤〔杭州天和微生物试剂〕，噻唑兰、MTT(上海金穗生物科技〕，二甲基亚砜(天津致远化工〕，引物〔上海生工生物工程〕，BiometraPCR仪〔BIOME-TRA，德国〕，SMARTSPECTMPLUS超微量分光光度计(美国〕，琼脂糖〔西班牙〕，PBS缓冲液〔博士德生物〕。1.2方法1.21菌悬液的制备首先取粪肠球菌标准株接种于装有BHI液体培养基的试管中37°C摇床厌氧复苏24h。将复苏后的粪肠球菌划线接种于BHI琼脂培养基中，放置在37C恒温培养箱里厌氧培养24h。挑取24h后固体培养基上的单个菌落放置于装有BHI液体培养基的试管中，37C摇床里培养24h;最后利用麦氏比浊法配制菌悬液并使其浓度到达0.5McFarland(1X108个细胞/mL)。1.22药液的制备取木犀草素标准品用二甲基亚砜溶解使其浓度到达16mg/mL，过滤后，利用对倍稀释法将木犀草素稀释成8、4、2、1和0.5mg/mL的浓度，备用。1.23木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑菌性的研究用灭菌后96孔板，向每孔中放50pL的粪肠球菌菌悬液和150pL的BHI液体培养基，封口膜密封，37C条件下厌氧培养24h(激光共聚焦〕观察，待成功建立粪肠球菌生物被膜模型，严格贴壁去除原液体，同时随机分7组包含5个实验组、1个阴性对照组、1个空白对照组；分别向实验组中参加100PL的浓度为8、4、2、1和0.5mg/mL的木犀草素药液，阴性对照组含有液体培养基和菌悬液，空白对照组只含有BHI液体培养基；将96孔板放于培养箱中37C条件下厌氧培养12h。12h后无菌PBS冲刷2〜3次去除药液。每孔中参加20PLMTT药液〔浓度为5mg/mL)，37C避光培养4h。每孔放100PL的二甲基亚砜溶液，摇床震动15min；待结晶体消失后，全自动酶标仪分别检测490nm的吸光度〔A值〕。如下公式计算：抑菌率=(阴性对照组A值一实验组A值〕/(阴性对照组A值一空白对照组A值〕X100%。1.24CLSM观察不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的影响将经高压灭菌后的20mmX20mm的盖玻片放在6孔板中，分别在盖玻片外表滴加300PL的粪肠球菌菌悬液，再沿6孔板的侧壁向其中小心参加3mL的BHI液体培养基，封口膜封口，37C恒温培养箱厌氧条件下培养24h。经共聚焦检测确定生物被膜模型建立成功后，去除原培养液同时将其随机分为6组〔5个实验组和1个阴性对照组〕，分别向5个实验组中参加浓度为8、4、5、1、0.5mg/mL的木犀草素药液，阴性对照组中不加药液，封口膜封口，继续厌氧培养12h。12h后去除液体。PBS小心冲刷2〜3次去除外表浮游的细菌；然后滴加2.5%的戊二醛固定10min，再次用PBS缓冲液小心冲刷2〜3次后，分别在生物被膜外表滴加150pL染色剂〔AO、EB等份混合后0=20稀释成工作液〕，暗室室温孵育15min后，用CLSM观察生物被膜中死菌与活菌的密度及其比例(镜下活菌呈绿色，死菌呈红色〕。1.25木犀草素对粪肠球菌的毒力因子影响的研究0.25.1分组处理和PCR扩增选取适应浓度的木犀草素〔8、4、2和0mg/mL)，分别参加到配制好的粪肠球菌菌悬液中。置于37C厌氧条件下培养24h后，分别取1mL样本按TotalRNA提取试剂盒(RNAISOTMPlus)要求提取其总RNA；并用RNAPCRKIT(AMV)VER30试剂盒反转录合成cDNA。同时用由上海生工生物合成设计的3对引物〔见表1)，按PCR反应试剂盒说明，通过PCR仪，对粪肠球菌毒力因子gelE、ebpA、esp进行PCR扩增。扩增后的PCR产品，置一20C冷冻冰箱，备用。0.25.2琼脂糖凝胶电泳及其分析取0.6g的琼脂糖粉末与40mL1XTAE电泳缓冲液混合,加热至全部溶解后,再向其中参加0.4PL的EB,混合后，沿侧壁缓慢使液体流入胶板中，冷却制成凝胶。将样本〔8pLPCR扩增产品+2pL的6XLoadingbuffer混合液)滴参加凝胶小孔中，于120V,30min条件下进行电泳。电泳30min后，取下凝胶置于UVI成像仪上。观察结果并进行拍照，最后利用软件进行分析。1.3统计学分析所有数据均采取SPSS17.0统计软件进行整理和统计。计量资料采取均数士标准差(王±0表示。两组间计量资料的比较采取z检验。P0.05为差别有统计学意义。2结果21不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制率不同浓度的木犀草素作用于粪肠球菌生物被膜24h后，运用MTT法测各组的A值并计算木犀草素的抑囷率；最后的结果显示：在0.5〜8mg/mL的浓度区间随着药物浓度的增长其抑菌能力也加强。木犀草素的浓度为0.5mg/mL时其抑菌率为40.02%。当到达8mg/mL时抑菌率为90.55%。而且各组的抑菌率分别与阴性对照组相比差别均有统计学意义〔P〈0.05)(见表2)。表2不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制率随着药物浓度依次增长各条带的亮度逐步变暗。〔2)当药物浓度到达8mg/mL时各毒力因子的条带基本消失。〔3)各组别与阴性对照组两两比较，差别有统计学意义〔P〈0.05)，见表3。说明木犀草素不同水平的抑制了粪肠球菌毒力因子gelE、esp、ebpA的表达；而且随着药物浓度的增长其抑制效果逐步增长。22木犀草素对粪肠球菌生物被膜的影响不同浓度的木犀草素作用于粪肠球菌生物被膜，通过AO和EB染色后，CLSM镜下观察活菌和死菌的密度及其比例。在0.5〜8mg/mL浓度区间内CLSM观察到死菌的数量逐步增长。说明木犀草素对粪肠球菌生物被膜的生长活性有抑制造用〔见图1)。23不同浓度的木犀草素对粪肠球菌的毒力因子gelE、esp、ebpA基因表达水平的影响最后的PCR扩增产品进行电泳后的结果显示：〔1)阴性对照组时毒力因子gelE、esp、ebpA的电泳条带最亮，药物浓度为2mg/mL时其条带的亮度次之，但3讨论木犀草素是中药夏枯草(LuteoUn)的重要有效成分之一。木犀草素属于黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、保卫心血管、解痉、祛痰、抑制酶活性、免疫调节、抗氧化、抗辐射、利尿、利胆、抗肿瘤等等多种特性[4]。有研究报道夏枯草对肠道致病菌和条件致病菌具有较强的抑制造用，但对于木犀草素对粪肠球菌的作用尚没有研究，故本实验选取夏枯草中的木犀草素成分作为研究对象，讨论其对粪肠球菌的作用。实验最后的结果显示：在05〜8mg/mL，木犀草素对粪肠球菌生物被膜能起到抑制效果，而且随着药物浓度的逐步增长其抑菌效果也逐步明显，当浓度达8mg/mL时，其抑菌效果最明显。3.讨论粪肠球菌在根管再治疗患者的根管中检出率高且数量多，极易构成生物被膜，产生抗药性，使治疗难度加大[6]。有研究报道：粪肠球菌极易在根管内构成生物被膜可能与其毒力因子明胶酶〔gelE)、外表蛋白〔Esp)和菌毛把持子〔ebpA)等有关系。gelE：是细胞外锌金属蛋白酶的一种，能够酶解宿主细胞壁和细胞间质的胶原蛋白[7]，它的长度大略为1530个碱基，位于粪肠球菌染色体上。粪肠球菌调节因子基因fe•和3个启动子位于其上游，能够影响明胶酶的表达水平。下游重要与其一起参与宿主的组织损伤，是丝氨酸蛋白基因SprE。明胶酶对组织的构成和重塑是通过胞外的降解作用来调节的。经研究发现去除giE基因后，粪肠球菌构成生物被膜的能力下降[8]。ebpA:ebp基因座重要影响菌毛构成，而生物被膜构成的需要条件就是菌毛的构成。bpA是粪肠球菌菌毛把持子，经常发现于粪肠球菌分离株中，影响着生物被膜和菌毛的构成[]。有研究发现：与野生株比较，bpA表达水安然平静菌毛蛋白生成量减少，生物被膜构成量也会跟着下降[1°]。Esp：由1873个氨基酸构成的与细胞壁相关的蛋白，在粪肠球菌中它的外表分子质量最大，由5622个碱基对构成e#基因。e#基因的菌株可诱发多重感染，esp基因普遍具有构成生物被膜的能力，可使细菌的感染愈加持久，呈慢性长期的趋势，因而提升了感染能力[11]为了说明木犀草素对粪肠球菌的抑菌作用能否通过其相关毒力因子而完成。本实验选择与粪肠球菌生物被膜相关联的3种毒力因子gelE、esp、ebpA为研究对象，观察不同浓度作用后的变化。结果显示:〔1)木犀草素的浓度在0.5〜8mg/mL时，对粪肠球菌的3种毒力因子gelE、esp、ebpA的mRNA的表达均有不同水平的干扰或抑制造用。即随着浓度的增长，其对3