发酵培养基a资料

发酵培养基a资料第1页/共86页发酵培养基的要求培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。第2页/共86页第一节培养基的类型及功能一、纯度合成培养基:原料其化学成分明确、稳定适合于研究菌种基本代谢过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产天然培养基:采用天然原料原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型

第3页/共86页一、按纯度培养大肠杆菌常用两种培养基LBMedium(LB培养基Luria-Bertanimedia)YeastExtact(酵母膏)5gTryptone(胰蛋白胨)10gNaCl10gDistilledwater(蒸馏水)1000mlpH7.0第4页/共86页M9MediumBrothNa2HPO46.8g;KH2PO43.0g;NaCl0.5g;NH4Cl1.0gM9CABrothCasaminoAcid2.0g;Na2HPO46.8g;KH2PO43.0g;NH4Cl1.0g;NaCl0.5g.第5页/共86页固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。二、按状态第6页/共86页三、按用途（从发酵生产应用考虑）培养基按其用途可分为斜面（孢子）培养基种子培养基发酵培养基第7页/共86页第二节发酵培养基的成分及来源一、碳源1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃第8页/共86页①葡萄糖glucose

几乎所有的微生物都能利用但是会引起葡萄糖效应

p50

工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标3、工业上常用的糖类dextroseequivalent以D-葡萄糖干基来表示。糊精遇碘产生红色反应第9页/共86页不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大第10页/共86页②糖蜜molasses糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。

糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。第11页/共86页不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响第12页/共86页糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐第13页/共86页②淀粉starch、糊精dextrin使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格底难利用，可以解除葡萄糖效应第14页/共86页例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2第15页/共86页李江华，无锡轻工大学学报，2004(1.5g麸皮)(半纤维素酶)第16页/共86页嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型苏勤，林业化学与工业，2004第17页/共86页

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

1、无机氮源种类：铵盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，迅速利用的氮源(速效)。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

二、氮源第18页/共86页

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH所以选择合适的无机氮源有两层意义：第19页/共86页毛霉产蛋白酶的研究陈涛，中国酿造，2004初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大第20页/共86页无机氮源的影响：硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素第21页/共86页2、有机氮源来源：氨基酸工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉peanutmeal、黄豆饼粉SoybeanCakeMeal、棉子饼粉、玉米浆CornSteepLiquor、玉米蛋白粉CornGlutenMeal、蛋白胨peptone、酵母粉yeastpowder、鱼粉Fishmeal、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。P44成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。第22页/共86页例玉米浆CornSteepLiquor

①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸

②较多的乳糖

③硫、磷、微量元素等有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响有机氮源的来源具有不稳定性所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响第23页/共86页加工方法水分粗蛋白粗脂碳水化合物灰分冷榨12.1246.456.1226.245.44热榨3.3847.943.7422.846.31热榨豆饼和冷榨豆饼的主要成分含量成分第24页/共86页

有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质

有些产物会受氮源的诱导和阻遏例：蛋白酶的生产

有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力

开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题氮源使用的一些相关问题：第25页/共86页1、作用：各种不一样p45-472、来源：C、N源以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑三、无机盐及微量元素P、S、Mg、Fe、K、Na、Cu、Zn、Mn等。第26页/共86页例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响

pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟第27页/共86页

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

1、生长因子

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子四、生长因子、前体和产物促进剂第28页/共86页青霉素G：分子量356苯乙酸:分子量1362、前体前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高第29页/共86页作用：前体有助于提高产量和组份用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%

例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：13.8/[(0.337/0.6)*36]=68%实际使用时的转化率在46-90%之间80%以上的苯乙酸最后用于青霉素生产第30页/共86页用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利

苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化流加也有利于提高前提的转化率第31页/共86页所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。3、产物促进剂第32页/共86页

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。第33页/共86页

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。五、水第34页/共86页

目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

第三节发酵培养基的设计和优化第35页/共86页

菌种的同化能力

代谢的阻遏和诱导

合适的C、N比

pH的要求

一、培养基成分选择的原则第36页/共86页理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。

实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小

如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标

二、成分含量的确定（一）、理论转化率与实际转化率

第37页/共86页例:

如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下∶

葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为∶

C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖转化为酒精的理论得率为∶

2*46

Y=───=0.57162第38页/共86页第39页/共86页

培养基成分的含量最终都是通过实验获得的

合理的实验方法多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。多因子实验（二）、实验设计第40页/共86页③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；三、培养基设计的步骤第41页/共86页类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健第42页/共86页原培养基第43页/共86页

初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)第44页/共86页考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好

通过单因子实验确定适宜的培养基成分

(以碳源为例)第45页/共86页

正交设计确定优化的配方第46页/共86页第47页/共86页碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%

酵母膏0.03%无机盐:复合无机盐0.05%结果第48页/共86页改进后培养基原培养基改进后培养基的发酵结果第49页/共86页摇瓶、反应器培养基研究的两个层次

摇瓶——培养基设计的第一步

反应器—最终的优化的基础配方四、摇瓶水平到反应器水平的优化第50页/共86页例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%

补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大第51页/共86页摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础第52页/共86页发酵罐：反应器水平,

可以得出最终优化的基础配方第53页/共86页pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究第54页/共86页

pH控制摇床在1,3-丙二醇发酵中的应用华东理工大学第55页/共86页1,3-丙二醇的用途：最重要的用途是作为单体与对苯二甲酸丙二醇聚合生产聚酯：聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)可作为增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂等用于食品、化妆品和制药等工业第56页/共86页PTT的性能PTTPET涤纶Nylon尼龙、锦纶Acrylic亚克力Spandex(Lycra)莱卡、氨纶柔韧度++-++NA弹性+-----++丰满度++----+NA磨损++++---抗污染力++++------洗涤牢度++++------日晒牢度++-++--抗静电力++++----NA色彩密度----+++--成本---++-+--PTT最目前性能最好的纤维被誉为21世纪的大型纤维第57页/共86页1,3-丙二醇两步发酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等第58页/共86页伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇的代谢甘油三羟基丙醛1,3-丙二醇二羟丙酮丙酮酸乙酸乙醇乳酸丁醇丁酸丁二醇2HH2OpH下降厌氧过程、pH下降2H第59页/共86页不同pH条件对甘油消耗的影响第60页/共86页摇瓶培养基分批培养过程结果第61页/共86页补料培养过程甘油

浓度为3.43%，对甘油转化率为19%

第62页/共86页

1,3-丙二醇的浓度5.37%，转化率为40%进一步优化培养基后过程第63页/共86页

1,3-丙二醇的浓度为6.72%，对甘油转化率为

54.7%，生产强度为1.9g/L.h。进一步优化条件后第64页/共86页

原料及设备的预处理

原材料的质量

发酵特性的影响

在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。

五、培养基设计时注意的一些相关问题第65页/共86页

灭菌

在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提

有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。

有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法

Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3第66页/共86页

大肠杆菌高密度度培养：碳源：葡萄糖、甘油氮源：胰蛋白胨、酵母粉无机盐：磷、镁等第四节、重组产品培养基的介绍第67页/共86页蛋白胨、酵母粉(OXOID)章越，生物工程学报，2004第68页/共86页

动物细胞培养基基础培养基:F12、DMEM等血清(5-10%)：胎牛(FBS)、小牛(CS)、马(HS)水：超纯水其它：NaHCO3（CO2）、抗生素第69页/共86页GONG,J.B.B.2003Methotrexate甲氨蝶呤MTX：叶酸拮抗药抑制细胞繁殖第70页/共86页

培养基—菌体生长所需的营养以及其它必须的条件

了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以及其中的基本概念

发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题，掌握发酵培养基优化与设计的思路，了解其中的方法小节第71页/共86页聚类分析在红霉素摇瓶培养基

无机盐分析中的应用摇瓶培养基（/100ml):淀粉3g，糊精4g，黄豆饼粉3g，硫酸铵0.2g，碳酸钙0.6g，豆油0.2ml/25ml培养基罗致强,宫衡,付水林.聚类分析在红霉素摇瓶培养基无机盐分析中的应用[J].中国抗生素杂志,2006,31(3)聚类分析(clusteranalysis)是一组将研究对象分为相对同质的群组(clusters)的统计分析技术第72页/共86页A：黄豆饼粉3%；B：棉籽饼粉2.37%

C：酵母粉2.74%；D：玉米浆（固体）2.8%697151882262373202000400060008000ABCD红霉素效价(U/ml)第73页/共86页A：黄豆饼粉3%；B：黄豆饼粉1.5%+棉籽饼粉1.18%；C：黄豆饼粉1.5%+酵母抽提液0.96%；D：黄豆饼粉1.5%+蛋白胨（进口）0.78%；E：酵母粉2.74%；F：棉籽饼粉2.37%；G：蛋白胨（国产）1.47%；H：蛋白胨（进口）1.57%；I：酵母抽提液1.91%；J：棉籽饼粉1.18%+酵母粉1.37%；K：棉籽饼粉1.18%+蛋白胨（国产）0.74%；L：棉籽饼粉1.18%+蛋白胨（进口）0.78%；M：酵母粉1.37%+酵母抽提液0.96%；N：蛋白胨（国产）0.74%+蛋白胨（进口）0.78%。设计A—N种氮源组合（蛋白质含量相同）：第74页/共86页钾(mg/100ml)镁(mg/100ml）锌(mg/100ml)铁(mg/100ml)铜(mg/100ml)磷(mg/100ml)效价（µg/ml）A48.5517.3130.13190.78820.033018.6117099B41.5539.9440.15530.53980.038822.9396355C52.2066.8740.12730.56490.017431.9522883D24.4114.5380.08960.42150.017315.3975806E47.6685.6100.13430.46090.021137.9242136F34.70012.6290.17940.29270.044927.3825323G23.7530.0350.00950.02660.00157.1596170H0.2731.7750.04770.05520.001612.2612100I55.5696.4020.12200.33980.001945.0563036J41.1119.0930.15650.37620.032932.5954274K29.2346.3050.09410.15910.023117.2374607L17.4137.1700.11300.17320.023119.7254853M51.7646.0220.12850.40120.011541.6081890N12.0930.8990.02850.04080.00159.6953766不同有机氮源培养基中无机盐含量及对应红霉素效价第75页/共86页 Cluster

1 2 钾 31.37 37.24 镁 6.85 5.24 锌 .11 .11 铁 .34 .32 铜 .03 .01 磷 18.35 30.16 效价 5744.71 2869.29运用SPSS软件中的快速聚类分析方法（K-MeansClusterAnalysis）对无机盐进行了分析，将各种无机盐含量分成高低两类第76页/共86页根据聚类分析结果可以将各种无机盐高低两个水平下对应的效价分成两类。这两类效价之间是否存在显著差别，即各种无机盐的高低两个水平对效价的影响是否显著，本实验用两独立样本t检验进行了分析。第77页/共86页其中A—N表示各种氮源组合，*号表示t检验结果存在显著差异。

高水平类低水平类高水平类对应平均效价低水平类对应平均效价极差显著性P值钾ABCEFIJMDGHKLN412245504280.663镁ABCEFIJKLMDG