华大基因科技产品手册

22/目目 一、RNA类产 （一）转录组 真核转录组de 原核转录组真核转录组 原核转录组 （二）表达 fication SmallRNA与mRNA联合分 （三）非编码 真核Small （四）降解 二、DNA类产 （一）重人全组重 RAD-SeqBin

MHC

（二）de 33/动植物de 叶绿体/线粒体de 真菌de 细菌denovo 细菌Optical BAC/Fosmidde （三）表 组Bisulfite甲基 （四 分 Illumina分 Affymetrix分 谱SNP检 三、Meta类产

16S/18S/ITS

四、质谱平台产 （一）蛋白类产 Ⅰ蛋白鉴定 全谱分 胶点鉴定、胶条鉴 蛋白分子量测 Ⅱ蛋白定量 Ⅲ目标蛋白 Ⅳ蛋白修饰 蛋白磷酸化分 五、常规服 （一）Sanger业 44/Fosmid文库构 Shotgun文库构建及cDNA文库构建及EST酵母双杂交文库构 PCR重/SNP检测/walking 细菌、真菌菌种鉴 单个样品 BAC文库构 （二）合成业 合 六、其他产 （一）生物云计 （三）RNA提取协助服 修订记 PAGEPAGE6/deRA0101:denovoHS-702-1002：91PE（HiSeq4000）HS-702-1003：101PE（HiSeq4000）XB0101：XbiodenovomRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，而由于目前蛋白质实验技以及一些RNA提取、容易降解的特殊样品等高通量需求。cDNA部分序列，代表一个完整的一小部分,在数据库中其长度一般从20到7000bp不360±120bp[1,2]EST来源于一定环境下mRNAcDNA文库，因此EST也能说明该组织中各的表达水平[3]。研究（microarray）是将来进行分析表达差异[4]。高通量技术研究转录本则是利用第二代技术，直接对其是基于Illumina高通量平台的转录组技术能够在单核苷酸水平对任意物种的整1转录组研究技术比较 cDNAESTSanger 高低高是否高低低是是>8000是是转录组denovo是指在不需要物种组详细信息的情况下，用第二代高通量117/策略：Hiseq平台，推荐PE101或PE151并与引物结合，在一定的反应体系下，在PCR仪上按照相应程序合成一链cDNA；cDNA双链的粘性末端进行修复，使之修复成平齐末端，并回A碱基，为接下来的接头连接做准备；PCR反应及产物回收：PCR扩增连接产物，并对产物进行纯化回收，最后贴上，文库文库质量检测：构建好的文库使用Agilent2100Bio yzer和ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem进行质量和产量的检测。mRNAmRNAcDNA成TotalPCRcDNA第二链合加2denovo8/3denovoUnigene功能注释及COG9/*Unigene等同于“转录本”或“Transcript”2denovo构建完成的文库，采用Agilent2100检测浓度和片段长度，并用qPCR检测文库的摩尔浓度。文库片段大小，浓度必须符合IlluminaHiseq上机标准。adapter去除含N5%10/合格4RawreadsATCG波动大，ATCG5Rawreads11/PAGEPAGE14/果文件包括组装和注释两个部分。contigunigene组装的详细信息在组装文件夹下。注释Nr、Swissprot、NT、COG、KEGGGO预测结果，SSRSNP对于数据量低于50G的项目，华大提供免费的FTP服务，数据在（）或者（。如果数据量小于50G表5录组dem≥228S/18Level1μg≤m<2LevelAgilentm≥40028S/18Level400LevelAgilentm≥2c≥20Level1μg≤m<2LevelAgilentm≥228S/18Level1μg≤m<2LeveldscDNA真包括PCRm≥2c≥151K以上Level1μg≤m<2Level去rRNA的Agilentm≥0.2c≥20ng/μL1K以上Level LevelB：B类样品，指的是质量满足建库要求，且总量可以满足1次但不足2次建库LevelC：C类样品，指的是质量不完全满足建库要求，可以风险建库但不保证测真核转录组denovo周针对性的自主软件开发：tophat、cufflinksRNA分析软件及华大作伙伴的个性化需求，信息分析团队在不断进行RNA分析软件的开发和现有信息分析mRNA；另外，核酸杂交的背景噪音很高，存在交叉杂交现象。转录组是直接对下，通过转录组您还可以分析可变剪切、结构变异、全组水平表达丰式无关。如果不设生物学重复，高影响因子的可能会因此而拒稿。Q6：核酸平台是否会对客户样品进行DNaseA6：DNaseDNaseQ7：普通反转录技术和SMARTSMARTmRNAQ8：SMART“帽子结构”GcDNAdC，SMART用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。15/PAGEPAGE16/Wangetal.DeNovoassemblyandcharacterizationofroottranscriptomeusingIlluminapaired-endsequencinganddevelopmentofcSSRmarkersinsweetpotato(Ipomoeabatatas).BMCGenomics.2010,11:726.案例描述：利用转录组技术（denovo）建立第一个甘薯转录组数据库，并开发yzerIIx（PE75产出：>59Mreads，平均75-mer1759831.14%)Unigenes被分到124个，且可用于点制高密度以便于将来用于鉴定块状根形成和发育这些生物进程中的表达谱。成千的cSSRs标记在本研究中被鉴定出来，丰富了甘薯的利用MISAPerlscript从组装出的unigene中,开发出4,114个候选cSSRs标记，选取100个标记（44个在编码区，21个在5’UTR，13个在3’UTR,,22），6.0设计引物，用于扩增验证和估算混合组DNABLASTx软件与Nr数据库，Swiss-ProtCOG数据库比对：总计有个11983个unigenes分别GOCOG分UnigeneGO和COG材料获取：甘薯块茎三个生长发育阶段：直径0.5-1.0cm最初的块根;直径3.0-3.5cm膨胀的块根和直径>5.0cm成 片段长度为200bp（25bp）cDNA文库构建。

61DeNovoAssemblyoftheManilaClamRuditapesphilippinarumTranscriptomeProvidesNewInsightsintoExpressionBias,MitochondrialDoublyUniparentalInheritanceandMol.Biol.Evol.的组，不同的表型需要的差异表达。此外，蛤蜊的线粒体双重单亲遗传现象(DoublyUniparentalInheritance,DUI)会影响其生殖细胞的分化。为揭示蛤蜊的分化遗传控制，本文利用IlluminaGenomeyzerII平台，对菲律宾蛤蜊的转录组进行了分析，探究了蛤蜊的分化控制。3 *2个家系=24个样品，各样品分别提取totalRNA，加入 策略：IlluminayzerII进行71b。产出 共产生了约900,000,000个reads 进

应用BLASTx软件与有8713个

Burrows-WheelerAlignmenttool将各样品数据与组装好的到差异表达：1,575个基因在不同各种中有差异表达，165个在两个家系中有差异表达，47个的表达受到家系和的双重影响。

Blast2GOV.2

SAMtools与组装好SNPs检测：各样品的SNPs范围在14740到27666中166个SNPs与PAGEPAGE19/

图72BoguskiMS,TolstoshevCM,BassettDEJr.GenediscoveryindbEST.ScienceGerhardDS,etal.Thestatus,quality,andexpansionoftheNIHfull-lengthcDNAproject:the lianGeneCollection(MGC).GenomeRes.2004,14:2121–2127.WangZ,GersteinM,SnyderM.RNA-Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics.NatureReviewGenet.2009,10(1):57–63.RoyceTE,RozowskyJS,GersteinMB.Towardauniversalmicroarray:predictionofgeneCloonanN,etal.Stemcelltranscriptomeprofilingviamassive-scalemRNANatureMethods.2008,HansenMB,VerdurmenWP,etal.Amodularandnoncovalenttransductionsystemforleucine-zipper-taggedproteins.Chembiochem.2011,12(15):2294-7.fragmentsFPKM(A)UnigeneA的表达量，则C为唯一比对到UnigeneAfragments数，N为唯一比对到所有Unigene的总fragments数，L为UnigeneA的碱基数。FPKM法能消除长度和量差异对计算表达的影响，计算得到的表达量基于的差异方法，通常是对差异检验的p-value作多重假设检验校正，通FDR（FalseDiscoveryRate）p-valueFDR值同时，采用表达量计算方法RPKM（readsperkilobaseofexonpermillionmappedsequencereads）法计算在不同样本间的差异表达倍数。以FDR≤0.001且存在2倍以上表达差异作为图8差异统计图(VS前为对照组差异表达GeneOntology功能显著性分表6根据筛选出的差异，GO功能显著性富集分析首先把所有差异表达向GeneOntology数据库（）的各个term映射，计算每个term的数条目。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达行使的主要生物学功能。表6差异表达pathway显著性富集分与GO富集类似，对差异表达的与各信号通路进行分析，寻找具有显著性富集的pathway，通过Pathway显著性富集能确定差异表达参与的最主要生化代谢途径和信号9KEGGBcellreceptorsignalingpathway 一般在200bp以下，其两端的序列高度保守，可设计引物进行PCR扩增，揭示其多态性。20/基于转录组的SSR检测是以组装出来Unigene作为参考序列，使用SSR软件 SOAPsnp是SOAP中的一员。它也是一种重工具，可以为基于原始片段在主成分分析（principalcomponentsysis，PCA）是一种简化数据集的技术，它把原集的维数，同时保持数据集的对方差贡献最大的特征。R语言中的p函数可以进行21/2222/113D功能分析，可以揭示出样品中正在发生的特异性生物过程，并可以辅助RNA层次的biomarkers开发。令ei(g)为g在样品i中的reads数则g在所有样品中的reads数为 令si为样品i中所有reads数则期望的每个在样品i中的reads数与 对于g如果它在所有组织中均匀地表达则期望的它在组织i中reads数为fi=E(g)pi。定义expressionenrient(EE)EEi(g)=ei(g)/fi(g)，即g在样品i中的reads数观测值对期望值的比例。更大的EEi(g)代表着g更加偏向于在样品i中表达。同时，为了评估一个较大的EEi(g)值是由于偶然因素而不是真实的偏向性表达情况，为expressionenrient值定义一个P-value，它由如下给出：我们通常定义满足：EEi(g)>5和Pi<10−3.5的为条件特异表达2323/图12条件特异表达统计图PAGEPAGE25/

RA0106:ResequencingHS-702-1002：91PE（HiSeq4000）HS-702-1003：101PE（HiSeq4000）XB0102：XbioResequencing转录组的研究对象为特定细胞在某能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，该产品目前主要针对mRNA。转录组是连接组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录组研究是功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量，能够全1DGE低中高高否否是否否是2626/11策略：Hiseq平台，推荐PE101或PE151首先对合格的样品进行DNaseI消化，然后用oligo（dT）磁珠分离出mRNA，用超声图2转录组建库流dUDNAUNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)可以选择性水解断裂链（负链）即可上机，进行边合成边；在的过程中先测得一些是正链reads，再测得一些是负链reads，在这些序列比对到参考组或参考时，那些比对到互补链物加以区分开。这些反义转录产物最后均可进行SNP，表达量等信息分析。下图为转录组27/图3链特异性转录组建库流++28/4reads的处理29/分析，例如，“在激素处理后2小时、4小时、8小时皆有差异表达的”）差异表达Pathway显著富集分15).Indel 第1,2,3,4,7,9-14,23条4-1018-1921-2230/PAGEPAGE31/表2真核转录组Resequencing质控内针对RNA样本，采用电泳、NanoDrop、AgilentBio yzer等方法进行样品检测。样构建完成的文库，采用Agilent2100检测浓度和片段长度，并用qPCR检测文库分子浓度。文库片段大小，浓度必须符合IlluminaHiseq上机标准。去除含N10%的5Rawreads6Rawreads曲线较平缓，不会有大的波动，AT，C与G的曲线基本重合，N贴平。Reads普通组物种，建议4Gb；对于数据量低于50G的项目，华大提供免费的FTP服务，数据在（）或者（）。如果数据量小于50G，；Windows用户：推荐winRAR 文件打开或浏览方法：txtWindowsEditplus或UltraEdit作为浏览程序，否则会因文件过大造成死机。UnixLinux系统比较适2100m≥228S/18Level1μg≤m<2LevelAgilentm≥40028S/18Level400LevelAgilentm≥2c≥20Level1μg≤m<2LevelAgilentm≥228S/18LevelLeveldscDNA真核LevelLevelrRNAAgilentLevelLevelLevelB：B类样品，指的是质量满足建库要求，且总量可以满足1次但不足2次建库A1：RNA提取质量的好坏主要取决于样品本身的质量即新鲜程度。除此外，Invitrogen公pBIOZOL试剂或CTAB-PVPLiClQIAGEN公司的RNeasylipidminikit进行提取。dUTPcDNATU。UNG酶能特异性模板就只剩下cDNA一链。下机后的reads1mRNA负链，reads2mRNA正链。A6:转录组后可通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术来验证结果华大科技与合作伙伴共同对一个人进行了转录组和小RNA研究，在该个22，688RNA编辑现象，绝大多数突变（~93%）AI(G)，这与已知的RNA依赖嘌呤脱氨酶作用机制相一致（下图。7RNA为Malat1/NR_002819。在炎黄转录组数据中发现的RNA编辑位点用红色框标出，绿色框代表DARNED数据中发现的编辑位点。在水稻转录组项目中，研究人员发现了很多新的转录本。通过与水稻cDNA数据图8转录组与cDNA相比可以发现低拷贝转录A.新鉴定转录本长度分布；B.新转录本与cDNA表达水平比较华大科技与其合作伙伴携手，对来自14个的癌样本以及它们的正常组织对照样本进行了转录组研究，发现大量与癌相关的融合和其他突变现象（下图。14个肿瘤样本中，有3个（21.4%）具有TMPRSS2-ERG融合，2个新的融TT15195=352%(D)通过RT-PCR和Sanger来验证所发现的融合现科学家们利用转录组技术研究了拟南芥全组范围的可变剪接（下图，共发现UNG酶法链特异性文库构建方法的建立德国科学家在NucleicAcidsResearch上的一篇文献，阐述了利用UNG酶处理来获化掉。这样在后续的建库中就只剩下了cDNA一链，从而解决了常规转录组不能识别下图为同一在常规转录组及链特异性转录组情况下的reads比对情况。从中可以看出基PengZY,ChengYB,TanBCM,etal.Comprehensive ysisofRNA-SeqdatarevealsextensiveRNAeditinginahumantranscriptome.NatureBiotechnology.2012,30:253–260.ZhangGJ,GuoGW,HuXD,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.GenomeResearch.2010,20:646-654.RenSC,PengZY,MaoJH,etal.RNA-Seq ysisofprostatecancerinthe identifiesrecurrentgenefusions,cancer-associatedlongnoncodingRNAsandaberrantalternativesplicing.CellResearch.2012,1-16.MarquezY,BrownJW.S.,SimpsonC,etal.TranscriptomesurveyrevealsincreasedcomplexityofthealternativesplicinglandscapeinArabidopsis.GenomeResearch.2012, DmitriP,TatianaB,AlexeyS,etal.Transcriptome ysisbystrand-specificsequencingofcomplementaryDNA.NucleicAcidsResearch.2009,Vol.37,No.18.序。如果打断随机性差，reads偏向于来自特定区域，将会直接影响转录组的各项分析我们利用reads在上的分布来评价打断随机性。由于不同参考有不同长度，我们把reads在上的位置标准化到相对位置（reads在上的位置与长度的比值，cDNAmRNAcDNA然后片段化要好。我们的实验使用RNAfragmentation方案。图12.(Wang,etal2009)文库：RNA片段化和cDNA片段化的方法比化后深度的分布相对更均一，但在5’和3’端的分布较少。中，最大表达量与最小表达量的比值（或理解为动态范围）44RNA-seq9,560。图中Tag数目是酵母菌5000个ORFs18的平均深度。39/PAGEPAGE42/和转录本表达量统计 设FPKM(A)为A的表达量，则C为唯一比对到A的fragments数，N为唯一比对到参考的总fragments数，L为A编码区的碱基数。FPKM法能消除长度)13IGVIGV的组数据浏览方法，详见我们结题报告里提供的使用手册，信息请官网:。基于表达水平的分析（只针对多样品生物学重复是任何生物实验所必须的，高通量技术也不例外（Hansenetal.）。样关性。根据Encode计划建议的标准，属于生物重复的两个样品，相关性系数的平方141516基于的差异方法，通常是对差异检验的p-value作多重假设检验校正，通FDR（FalseDiscoveryRate）p-valueFDR值同时，采用表达量计算方法FPKM法计算在不同样本间的差异表达倍数。以FDR≤0.001且存在2倍以上表达差异作为判断表达差异显著的阈值，也可以选取更小的FDR阈值和更大的倍数差异，FDR值越小、倍数差异越大，则表明表达差异越显著。图17差异统计图(VS前为对照组组情况进行验证。我们利用cluster软件，以欧氏距离为距离距阵计算，对差异表达基因和实验条件同时进行分层聚类分析，聚类结果用javaTreeview显示，如下图。4444/变化倍数或表达量用不同颜色表示，对于差异聚类:红色表示表达上调，绿色表示表达差异表达GeneOntology功能富集分根据筛选出的差异，GO功能富集分析首先把所有差异表达向GeneOntology数据库（）的各个term映射，计算每个term的数目，然后过GO功能显著性富集分析能确定差异表达行使的主要生物学功能。计算如下：其中，N为所有中具有GO注释的数目；n为N中差异表达的数目；M为所有中注释为某特定GOterm的数目；m为注释为某特定GOterm的差异表达基p-valueBonferronicorrectedp-value≤0.05为阈值，满足此条件的GOterm定义为在差异表达中显著富集的GOterm。通过GO功能显著性4图19.GO分析中富集到的细胞功能（molucular_function）从属关系pvalue值的范围，层级从上往下依次细化，最底层标出富集到此TERM路径的基因ID.得到每个差异的GO注释后,我们用WEGO软件对差异做GO功能分类统计,从宏观上认识差异的功能分布特征,结果如图18所示.45/ 图20.GO差异表达pathway显著性富集分步了解的生物学功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，Pathway显著性富集中显著性富集的Pathway。该分析的计算同GO功能显著性富集分析，在这里N为所有中具有Pathway注释的数目；n为N中差异表达的数目；M为所有中注释为某特定Pathway的数目；m为注释为某特定Pathway的差异表达数目。经过多重检验校正之后，我们选择Qvalue≤0.05的Pathway定义为在差异表达中显Pathway。QvalueFDRp-value的一种校正。某一个假设检验的QvalueFDRFDRPathway46/ 注：Qvalue≤0.05Pathway21Pathway注：Qvalue≤0.05Pathway21Pathway注：KEGG数据库中Bcellreceptorsignalingpathway的详细信息。在图中，上调用红框47/ 20的pathway异表达的中位于该pathway条目的数目与所有有注释中位于该pathway条目的总数的比值，RichFactor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做过多重假设检验校正20的pathway图22.KEGG蛋白互作网络分析整合了BIND、BioGrid、HPRD等相互作用网络数据库的组成.结果Medusa软件显示.进入网页版的界面如下(注:需要蛋白相互作用数据库中有该物种的注释信息):在文本输入框中输入ID号,便可得到如下所示的图（若找得到网络互作48/PAGEPAGE49/图22.差异的转录因子分析(适用于植物质,这些蛋白质能调控其靶的转录,具有DNA结合结构域和转录激活结构域。我们用hmmsearch搜索植物中的转录因子的特征结构域来预测编码转录因子的。针对数据的tophat的splicedjunction比对结果，后续采用RPKM(ReadsPerkbtranscriptomeperMillionreads)统计外显子的表达量，具体 C指的是唯一比对到外显子Areads数，由于存在一条read长度的中位数；Nreads数；L指的是外显子的长度（RPKM图23.用Cufflink软件对reads进行组装，将组装的转录本与参考序列的注释信息进行比5’3’16所示。图24结构优化方剪接研究在人、小鼠、拟南芥中发现了很多新的可变剪接。在生物体内，主要存在7种可变剪接类型：A）Exonskip；B）Intronretention；C)Alternative5'splicesite；D)Alternative3'splicesite；E)Alternativefirstexon；F)Alternativelastexon；G)Mutuallyexclusiveexon。下图是我们利用高通量数据鉴别出来的7种A)ExonSkip：AK070385发生可变剪接形成两种不同的转录本，第1种转录51/ 剪接形成两种不同的转录本，第2种转录本由retainedIntron与两侧的外显子一起形成新的外显子。C)Alternative5'splicesite：AK067602发生可变剪接形成两种不同的转录本，它们的3'端剪接位点一致但5'端剪接位点不同。D)Alternative3'splicesite：AK067602发生可变剪接形成两种不同的转录本，它们的5'端剪接位点一致但3'端剪接位点不同。E)AlternativeFirstExon：AK068497发生可变剪接形成两种不同的转录本，它们的不同之处在于第一个外显子不同。F)AlternativeLastExon：AK064908发生可变剪接形成两种不同的转录本，它们的不同之处在于最后一个外显子不同。G)MutuallyExclusiveExon：基因AK101575发生可变剪接形成两种不同的转录本，两转录本之间相同的外显子称为constitutiveexoninclusiveexoninclusiveexon不能同时存在与同转录本的组装转录本必须满足以下条件：距离现有的注释gene 200bp以上；长度不短于180bp；深度不小于2。图18所示为新转录本预测的方法。SNP（单核苷酸多态性SingleNucleotidePolymorphisms）在这里指的是样品的RNA序A，T，C或G的变异。流程中使用软件GATKSNP检测。GATK是由BroadInstitute研发的一款用于二代数据分析的软件包。该工具包提供大的处理引擎，高性能计算等特点使其在各类项目中得以广泛应用。GATK信息请参考。SNP检测后，使用AnnoDB做注释和分类，详细注释结果在文件[Sample-ID].snp.annot.csv，CSV格式，可用Excel等打开。也对SNP注释52/ 27SNPIdeaminasesthatactatRNA）的催化条款，使腺苷酸（A）变成了次黄嘌呤核苷酸（I）。并28RNA53/5454/ Indelpair-endreads进行开gapInDels（小的插入/缺失）。流程使用软件来检测制。目前融合的研究主要集中在的研究中，比如，白血病、癌、等，SOAPfuse(/soapfuse.html)分析软件是由华大自主开发的一SOAPfuse算法4个步骤：产生的reads与人组参考序列比对，并且注释转录PAGEPAGE56/HS-702-1002：91PE（HiSeq4000）HS-702-1003：101PE（HiSeq4000）转录组的研究对象为特定细胞在某能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，该产品目前主要针对mRNA。转录组是连接组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录组研究是功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量，能够全录组，与参考组比较，可以得到表达差异、GO功能分析、以及代谢通路分析目前用于分析转录表达的方法有表达、DGE、RNA-seq(定量）和转录组。转DGE低低高高否否是司高通量平台，通过信息分析，可以获得表达差异信息、SNP分析、预测新转录本等信息，这为研究的结构和的表达调控提供了一个重要的。原核转录组4.1技术流cDNA合成：用六碱基随机引物（randomhexamers）cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链；

1fq标准信息分析主要包括数据评估、表达注释、SNP分析，预测新转录本，筛选差 57/PAGEPAGE58/2标准信息分析（需提供参考序列、参考组序列及注释结果(reads的处理2..1评 2.3表达注 2.4.差异表达分析（两个或两个以上的样品，10次比对以上作为个性化分析条标准信息分析（无参考序列Unigene功能注释及COGUnigene的GOUnigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性分SNPSSR*Unigene等同于“转录本”或“Transcript”表2原核转录组质控内此步骤的质控用于检测样本的质量和浓度。通过Agilent2100TotalRNA的完整性以及浓度，同时还会运用NanoDrop检测样品是否存在盐离子等污染，为建库取样

4去除N10%的60/；获得cleanreads。5Rawreads6Rawreads61/PAGEPAGE62/对于数据量低于50G的项目，华大提供免费的FTP服务，数据在（）或者（）。如果数据量小于50G，3原核TotalLeveldscDNA不包括PCR产物、LevelrRNA的LevelLevelC：C类样品，指的是质量不完全满足建库要求，可以风险建库但不保证测46注：1.纯包含数据处理、报告撰写、报告提队在不断进行RNA分析软件的开发和现有信息分析平台的升级。PAGEPAGE64/PengZY,ChengYB,TanBCM,etal.ComprehensiveysisofRNA-SeqdatarevealsextensiveRNAeditinginahumantranscriptome.NatureBiotechnology.2012,30:253–260.ZhangGJ,GuoGW,HuXD,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.GenomeResearch.2010,20:646-654.RenSC,PengZY,MaoJH,etal.RNA-seqysisofprostatecancerinthepopulationidentifiesrecurrentgenefusions,cancer-associatedlongnoncodingRNAsandaberrantalternativesplicing.CellResearch.2012,1-16.MarquezY,BrownJW.S.,SimpsonC,etal.TranscriptomesurveyrevealsincreasedcomplexityofthealternativesplicinglandscapeinArabidopsis.GenomeResearch.2012,:DmitriP,TatianaB,AlexeyS,etal.Transcriptomeysisbystrand-specificsequencingofcomplementaryDNA.NucleicAcidsResearch.2009,Vol.37,No.18.PAGEPAGE65/

RA0104:SP-201-1101:原核链特异性转录组文库HS-702-1002：91PE（HiSeq4000）HS-702-1003：101PE（HiSeq4000）BA-101-1104:BA-301-1104:转录组的研究对象为特定细胞在某能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，该产品目前主要针对mRNA。转录组是连接组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录组研究是功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量，能够全原核链特异性全谱转录组和常规转录组类似，对提取的TotalRNA直接进行文库，分析内容。sRNA参与多种生物学过程，如和细胞分化（DicF、mRNA的稳定（oxyS（RNAI致病性（RNAIII）以及碳的(csrBC）等，sRNA的作用不断突出，越来越多的研究开始围绕sRNA，而原核链特异性全谱转录组为这一研究提供了很好的平台。目前用于分析转录表达的方法有表达、DGE、RNA-seq(定量）和转录组，转不仅能够对表达进行定量，而且还能够进行定性分析。原核链特异性全谱转录组各

DGE低低高高否否是否否否是是是原核链特异性全谱转录组通过对原核TotalRNA样本去rRNA后进行文库，采用Illumina公司高通量平台后进行信息分析，可以确定一条转录本是来自正义链还比常规转录组更精确统计转录本的数量，而且可以挖掘sRNA信息。链特异性文加“A”和接头：在cDNA上添加“A”6868/1数据以fq格式保存： 6969/23sRNAPAGEPAGE70/ 2.3.表达注 差异表达分析（两个或两个以上的样品，10次比对以上作为个性化分2.7.1子预3’UTR中Rho-independentterminatorPncRNA差异表达分析(两个或两个以上样品,10ncRNAncRNA靶预Unigene功能注释及COGUnigene的GOUnigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性SNPSSR*Unigene等同于“转录本”或“Transcript”表3原核连特异性全谱转录组质控内此步骤的质控用于检测样品的质量和浓度。通过Agilent2100TotalRNA的完整性以及浓度，同时还会运用NanoDrop检测样品是否存在盐离子等污染，为建库取样以及后期分析提供参考。2100检测基线平滑不，RIN值高代表样品RNA完整性好。运用实时荧光定量PCR对文库再次定量。5去除N10%的；获得cleanreads。6Rawreads7Rawreads

对于数据量低于50G的项目，华大提供免费的FTP服务，数据在（）或者（）。如果数据量小于50G，4组原核Total抬；5S峰正LevelLevelrRNA的56注：1.纯包含数据处理、报告撰写、报告提针对性的自主软件开发RNASOAP系列软件(SOAPsnp等)，针对转录组分析的共性问题和合作伙伴的个性化需求，信息分析团A3：链特异性最主要的是为了区分+/-UNG酶处理的过Denovo确定组装的Unigene有Refc.丰富的分析内容：TSS,Operon,UTR,SD序列预测，Rio-independent终止子，sRNA 德国科学家在NucleicAcidsResearch上的一篇文献，阐述了利用UNG酶处理来获化掉。这样在后续的建库中就只剩下了cDNA一链，从而解决了常规转录组不能识别下图为同一在常规转录组及链特异性转录组情况下的reads比对情况。从中可以看出基图 F为非链特异性比对图，G为链特异性比对图，正向的为蓝色，反向的为红色SorekR,CossartP.（2010）Prokaryotictranscriptomics:anewviewonregulation,physiologyandpathogenicity.NatRevGenet.11(1):9-16.SeilaAC,CalabreseJM,etal.(2008)DivergenttranscriptionfromactiveLeightonJ.Core*,etal.(2008)NascentRNASequencingRevealsWidespreadPausingandDivergentInitiationatHumanPromoters.Science.322(5909):1845–1848.PrekerP,etal.（2008）.RNAexosomedepletionrevealstranscriptionupstreamofactivehumanpromoters.Science.322(5909):1851-4.HeY,VogelsteinB.etal.(2008)Theantisensetranscriptomesofhumancells.Science.Semsey,S.,A.Dötsch,etal.(2012).ThePseudomonasaeruginosaTranscriptomeinnktonicCulturesandStaticBiofi UsingRNASequencing.PLoSONE.7(2):e31092.Hovik,H.,W.H.Yu,etal.(2011).ComprehensiveTranscriptome ysisofthePeriodontopathogenicBacteriumPorphyromonasgingivalisW83.JournalofBacteriology.194(1):100-114.A.Toledo-Arana,A.Dobin,etal.(2011).Genome-wideantisensetranscriptiondrivesmRNAprocessinginbacteria.PNAS.108(50):20172.DmitriP,TatianaB,AlexeyS,etal.Transcriptomeysisbystrand-specificsequencingofcomplementaryDNA.NucleicAcidsResearch.2009,Vol.37,No.18.Se（ fication ProtonRNA-Seq（ SP-201-1404：CGRNA-Seq(fication)文库构建（RNaseH探针法）SP-201-1405：CGRNA-Seq(fication)文库构建（OligodT调离法）HS-101-1001：50SEHS-901-1001：CGNorthernBlotRNA印迹，用于检测真核生物RNA的表达量及丰度估计，是研究真核细胞表达的基本方法。该技术的缺点是低通量，并且在检测稀有RNAs时灵敏度不够。tativereal-timePCR(qRT-PCR)即实时荧光定量PCRPCR，广泛用于表达研究，指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。可用于表达的定量和用DNA陈列技术检测证实的差异表达。实时PCR最大的缺点是价格昂贵。到目前为止，RT-PCR和NorthernBlot联合使用，可用于定量检测miRNAs。1995年，SAGE（SerialysisofGeneExpression,SAGE）技术首次出现[1]，它是一种外，对一些未知特别是低拷贝的发现起到巨大推动作用。SAGE技术首先从待检RNAcDNA，随后用一种被称为锚定酶的限制性内切酶(Anchoringenzyme)cDNAcDNA片段与不同的接头连接，再用酶酶切处理后得到SAGESAGE形成二聚体并进行PCR扩增，最后锚定酶切除接头序列以形成二聚体的多聚体，对其新一代高通量组仪的迅速发展(Solexa，454GS-FLX，SOLiD，tSMS)不仅给基过序列比对得到最后的转录组，标志着一个新的测定转录组的“RNA”法出现，该技术称为RNA技术(RNAsequancing,RNA-seq)。fication算出细胞的转录组表达水平。而且，数字表达谱升级版技术得到的长度比SAGE数字表达谱升级版（RNA-Seq(fication)）是用来研究某一生物对象在特定生平台丰富：提供Hiseq4000,IonProton,CG等多 80/表1.HiSeq4000,IonProton和CG平台之间的比HiSeq4000IonCGBlack4412-43run3slide，8以完成16个RNA-Seq（20Mclean每个样品建议10Mclean fication)产品目前仅提供20Mcleanreads/Total

1实验技术流程（HiseqProton平台81/用试剂盒去除rRNA即得到富集的mRNA；cDNAmRNA为模板，用六碱基随机引物进行反转录，合成双A并在连接酶的作用下PCRPCR反应体系对连接产物进行扩增，并用磁珠纯化；至此，文库文库质控：使用Agilent2100Bioyzer和实时荧光定量PCR进行质量和产量的利用Oligo(dT)利用Oligo(dT)末端修复，加接头后PCR2实验流程图（HiseqProton平台实验技术流程（CG平台TotalRNA的处理（RNaseH探针法和OligodT调离法，两种方法都能做RNaseH探针法（rRNA去除）DNArRNA,RNaseHDNA/RNA杂交链，再用DNaseI消化掉DNARNA82/ 形成双链DNA。入片段的3’端与接头之间有一个缺口。缺口平移及连接产物进行一步缺口平移补成完整的双链，然后PCR83/ Total

a.rRNA b.mRNARandomN6primer

Secondstrand HeatHeatSplint

DNB3CGRNA-SeqProton以bam格式保存84/4Reads在参考/组上的分布85/PAGEPAGE86/9）差异的蛋白互作网络分析；表1数字表达谱升级版质控内 针对RNA样本，采用电泳、NanoDrop、AgilentBioyzer等方法进行样品检测。样度，并用qPCR检测文库分子浓度。文库片段大小，浓度必须符合上机标准。(质量值Q≤10的碱基数占整条read的50％以上)。Proton平台：去除长度低于设定阈值（30）readsreadsadaptor，若修剪后口结尾到reads结尾的所有碱基，若修剪后长度小于设定阈值则去除。cleanreads/样品。对于数据量低于50G的项目，华大提供免费的FTP服务，数据在（）或者（）。如果数据量小于50G，表2aHiseq4000平台下送样建议和级别判定（针对RNA- ficationPAGEPAGE88/论2100m≥1028S/18上抬；5S5μg≤m<10Levelm≥428S/18上抬；5S2μg≤m<4Levelm≥10c≥200上抬；5S5μg≤m<10Levelm≥1028S/18上抬；5S5μg≤m<10LevelrRNAm≥0.1c≥15ng/μL1K以Level2100 上抬；5SLevel昆虫Total上抬；5SLevel动物Total上抬；5SLevelSe（fication2100m≥1028S/185μg≤m<10Levelm≥228S/181μg≤m<2Levelm≥10c≥2005μg≤m<10Levelm≥1028S/185μg≤m<10LevelrRNAm≥0.1rRNA比例于1KntLevel表2cCG平台下送样建议和级别判定（针对CGRNA-Seq（fication2100m≥528S/182.5μg≤m<5Levelm≥0.428S/180.2Levelm≥10c≥2005μg≤m<10Levelm≥528S/182.5μg≤m<5LevelmRNA，去rRNAm≥0.1rRNA比例于1KntLevelLevelB：B类样品，指的是质量满足建库要求，且总量可以满足1次但不足2次建库LevelC：C类样品，指的是质量不完全满足建库要求，可以风险建库但不保证测HiseqPAGEPAGE90/3030个，不能保证④一次送样超过384是编码的数量相差并不大，一般物种在3万左右，所以，对于一般物种RNA-Seq推荐10Mcleanreads数据量。ZhipengLiu,LichaoMa,etal.ComparativeTranscriptionalProfilingProvidesInsightsintotheEvolutionandDevelopmentoftheZygomorphicFlowerofViciasativa案例描述：利用转录组和RNA-seq技术，在组的尺度内，对豌豆的花进行单2、AP1主要在萼片和背向、横向、腹部花瓣中表达。AP3和PI主要在3种花瓣和中表达；AG主要在和心皮中表达；SEP1在6个花中都有表达；瓣的Unigenes，可能为阐明花序两侧对称的分子机制提供了重要线索；4、TCP的VsCγC1、VsCγC2、VsCγC3可能在控制豌豆花序两侧对称中起决定作91/ (1)ExpressionpatternsofthehomologoustranscriptsidentifiedbetweenvetchArabidopsisArabidopsis92/PAGEPAGE94/(2)(2)Theexpressionpatternsofsomekeyvetch51HifzurRahman,NJagadeeshselvam,etal.Transcriptomeysisofsalinityresponsivenessincontrastinggenotypesoffingermillet(EleusinecoracanaL.)throughRNA-sequencingntMolBiol(2014)85:485-503.影响因子迫下的粮食作物的遗传改良提供帮助（利用Proton平台。表达；同时会造成Trichy1中与黄酮生物合成相关的表达下调3、众多涉及光合作用的在盐胁迫下，在两种亚型中都表达下调，但在易感型CO12中Summarystatisticsofsalinityresponsivetranscriptomesequencingdatainthecontrastingfingermillet(Eleusinecoracana)genotypesanddetailsonmapofE.coracanatranscriptreadsagainstricereferenceReferencegenomesequencesusedformap;TIGR:O.sativassp.japonicaVenndiagramshowingthenumbercommonandgenotypespecificdifferentiallyexpressedgenes(DEGs)inresponsetosalinitystressintwocontrastingfingermilletgenotypes.DEGswereselectedbasedonfoldchange(twofold)andstatisticalsignificanceofρ=A.Thenumberoftranscriptsup-regulated(>twofold)duringsalinitystressinCO12andTrichy1;B.Thenumberoftranscriptsdown-regulated(>twofold)duringsalinitystressinCO12andComparisonofGeneOntology(GO)classificationsofdifferentiallyexpressed(DEGs)accordingtoGRAMENELocation,TIGRGOFunctionandKEGGPathwayinthesusceptibleCO12andthetolerantTrichy1inresponsetosalinitystress

62RoyceTE,RozowskyJS,GersteinMB.Towardauniversalmicroarray:predictionofgeneexpressionthroughnearest-neighborprobesequenceidentification.NucleicAcidsRes.2007,35,e99.WangZ,GersteinM,SnyderM.RNA-Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics.NatureReviewGenet.2009,10(1):57-63.MortazaviA,WilliamsBA,etal.Mapandfyingm liantranscriptomesbyRNA-Seq.NatureMethods.(2008).们需要经过一系列数据处理以去除杂质数据，从而得到cleanreads。Hiseq平台的原始数ATGCreads每个位置的碱基含量是否稳定来衡量建库、是否合格。正常情况下，reads每个位置的碱基含量分布稳定，无AT或GC分离现象。碱基质量分布反映了reads的准确性，仪、试图8a碱基含量和质量分布图（Hiseq平台图8b碱基含量和质量分布图（Proton平台3使用比对软件（Hiseq平台/CGBWA（Li,HandDurbin,R.,2009）将32)饱和度分饱和度分析可以在一定程度上判断数据量是否满足需求。随着数据量增长速度趋于平缓，说明检测到的数趋于饱和。图9饱和度正常情况下，Reads均匀地覆盖在全长的各个位置，然而样品降解、mRNA片段化时的偏向性、PCRReads的分布。同时，2009NatureReviewGenetics的一篇文章，展示了两种不同片段化方法对随机性的影响：

10RNAcDNA图11样品的Reads在参考上的分布均匀性统判断上感区段的Reads覆盖度、Gene数目分布等。对于未组装成的组序列，我们挑选最长的24条Scaffold进行作图。各个样品在组上的分布图如下：PAGEPAGE99/对于Hiseq平台/CG平台，使用RSEM工具（LiBandDeweyCN.,2011）进行表达定量。RSEM用Paired-end的关系、reads的长度、fragment的长度分布、质量值等，基于对于Proton平台，用Sailfish工具进行表达定量。Sailfish用k-mer来进行定量，首reference和k-merIndex，然后基于最大期望的算法建立最大似然的丰度估计模型，用以区分哪些转录本是同一个的不同亚型。水平定量结果（RSEM软件PAGEPAGE100/Encode计划建议的标准，属于生物重复的两个样品，相关性系数的平方（R2）应513示，而三个以上则无法按比例显示，最多允许做5个样品间的维恩图：14PCA作用。实际项目中，我们可以通过PCA找出离群样品、判别相似性高的样品簇等。PCA结主成分值，相似度高的样品通常会成簇，同时可以判别离群样品。15PCA3D条件特异表达分析（CG平台需要定制化来做功能分析，可以揭示出样品中正在发生的特异性生物过程，并可以辅助RNA层次的biomarker开发。101/令ei(g)g在样品i中的reads数，则g在所有样品中的reads数为E(g)=∑iei(g)。令si为样品i中所有reads数，则期望的每个在样品i中的reads数与pi=si/∑isi成比例，对于g，如果它在所有组织中均匀地表达，则期望的它在组织i中reads数为fi=E(g)pi.定义富集表达(EE)EEi=ei(g)/fi(g)，即g在样品i中的reads数观测值对期望值的比例。更大的EEi(g)代表着g更加偏向于在样品i中表达。同时，为了评估一个较大的EEi(g)P值，它由如下公(

E(g)Pg=∑ x)pi1−我们通常定义满足EEi(g)>5和Pi<10e-3.5的为条件特异表达。针对每个样品筛选出来的条件特异表达，会以xls文件（列的含义同定量结果并画出统图16样品特异表达统计软件包分析；③EBSeq6软件包分析；③EBSeq6差异表达分析结果（以基于泊松分布为例102/Noiseq软件包分析，用于筛选两组间差异表达，组内样品要求是生物重复。采取响因子13.6）的文献。研究发现大部分其他方法强烈依赖于深度，假阳性率会随readsNoiseq的则会保持的比较平稳；另外，Noiseq方法建立的噪声分布模M和3030M/D分布图（1626为i在g组所有样品中的表达量，然后用它算出i在组间（比如g=1,g=2这两组的差异倍数M和绝对差值DMi=log2(x1i)andDi=|xi−xix x2发生差异表达的概率P就是P(Gi=1|xi，xi)=P(Gi=1|Mi=mi，Di= 7差异表达分析结果（Noiseq分析包照组，其他若干个样品为groupB处理组，过滤条件为差异倍数不少于2及7差异表达分析结果（Noiseq分析包9.9表达模式聚类分表达模式相似的通常具有功能相关性。我们利用cluster软件，以欧氏距离为距离103/图17差异表达等级聚类上图为差异表达模式聚类图例子。每列代表一个实验条件(如exp1-VS-exp2),每行代表一个,不同表达变化倍数用不同颜色表示,红色表示表达上调,绿色表示表达下调。用鼠标点击左边箭头的线,其分支的线会变成红色,中间部分所显示的是左边选定部分的一个放大,最右边部分是左边选定部分所对应的ID或者注释。GeneOntology(GO)是一个国际标准化的功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表(controlledvocabulary)来全面描述生物体中和产物的属性。GO总共有三个ontology，分别描述的分子功能(molecularfunction)、所处的细胞位置(cellularcomponent)、参与的生物过程(biologicalprocess)。GO功能显著性富集分析提供与参考功能显著相关。该分析首先把所有差异表达向GeneOntology数据库()的各个term映射，计算每个term的数目，然后应用超几何检验，找出与整个组背景相比，在差异表达中显著富集的GO条目，通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达行使的主要生物学功能。GO功能分析中同时整合了immuneresponse为在差异表达中最显著富集的一个GOterm。104/PAGEPAGE105/8GO-行代表一个。红色表示上调，绿色表示下调。表达模式聚类分析所用工具为cluster和javaTreeview软件。图18参与immuneresponse的差异表达模式聚类参与的生物过程(biologicalprocess)三个部分，分别绘制富集到的TERM的从属关系图（对层级从上往下依次细化，最底层标出富集到此TERM路径的ID)：图19差异表达模式从属关系GeneOntology得到每个差异的GO注释后,我们用WEGO软件（Ye,J.,etal.,2006）对差异做GO功能分类统计,从宏观上认识差异 的功能分布特征,结果展示如下：20GO在生物体内，不同相互协调行使其生物学功能，基于pathway的分析有助于更进一步了解的生物学功能。KEGG是有关pathway的主要公共数据库(Kanehisa,etpathway显著性富集分析以KEGGpathway为单位，应用超几何检验，找出与整个组相比较后差异表达中显著性富集的pathway。Qvalue≤0.05的pathway定义为在差异表达中显著富集的pathway。通过pathway显著性富集能确定差异表达参与的最主要生

注：Qvalue≤0.05的Pathway在差异表达中显著富集，见表中红框所示差异表达的pathway显著性富集分析不但得到最有意义的pathway列表，点击其中的pathway还将得到KEGG数据库中pathway的详细信息，如点上表第一列第三行的：21KEGGBcellreceptorsignalingpathway此外，我们还对KEGG富集分析结果以图形化方式展示，见下方散点图列表。其中RichFactor指差异表达的中位于该pathway条目的数目与所有具有注释中位于该pathway条目的总数的比值，RichFactor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做过107/2020pathway22KEGG蛋白互作网络分析整合了BIND、BioGrid、HPRD等相互作用网络数据库的组成。结果Medusa软件(Hooperetal.2005)显示。进入网页版的界面如下(注需要蛋白相互作108/23因拖动时，其他相关会随着动；勾选Directed，显示相互作用的有向箭头；勾选Edgecolours，给边；点击Layout，Relax框变不可用，位置会重新布局，且拖动一个基此外，Cytoscape也是一款图形化展示网络并进行分析和编辑的软件，数据能直接图24蛋白网络互作分析图（利用Cytoscape软件109/差异的转录因子分析（适用于植物10转录因子又称为反式作用因子,是指能够结合在某上游特异的核苷酸序列上的蛋白质,这些蛋白质能调控其靶的转录,具有DNA结合结构域和转录激活结构域。我们用hmmsearch搜索植物中的转录因子的特征结构域来预测编码转录因子的。各组差异编码的相关转录因子信息结果示例如下：10110/PAGEPAGE112/

SmallRNAmRNARA0501：mRNA与小RNA小RNA和mRNA一直是功能组研究领域的热点与重点，小RNA和转录组、提高小RNA靶预测准确性，充分挖掘海量数据信息。注：小RNA样品和mRNA样品需要一一对应，或高通量数据均可使用；需要5对以上case+control样品的mRNA和smRNA数据。PAGEPAGE114/（三）非编码SmallSP-201-1302:TruSeqsmallRNA文库HS-101-1001:50SE（HiSeq2000）什么是smallRNASmallRNAmiRNA、siRNApiRNA。它们通过各种序列特异性的沉默作用，包括RNA干扰(RNAi)、翻译抑制、异染色质形成SmallRNA技术则是借助第二代高通量技术，对某物种某组织在特定状态下的鉴定出的相应已知miRNA和新miRNA进行靶预测。通过对miRNA靶的相关分析，GOpathwaymiRNA与相应表型差异关联起来，从而为解释smallRNA发展可靠性。RNA杂交的缺点是低通量，并且在检测稀有miRNAs时灵敏度不够。RAKEassay基于RNA引物阵列的Klenow酶(RNA-primedarray-basedKlenowemzyme，于Northernblot和其它的microarray基础上的分析平台。检测数量低于毫克的总RNA。这种方法的特点是无序列偏移，原位合成的DNA微阵列(DNAmicroarray)探针在序列和大小上均选择性的与成miRNA匹配，所需样本量小而产量高。以上微或者微阵列技术所具有的共同特征是可高通量检测miRNA，并可同时定PCRSQ-中，逆转录和连接反应共同把分析检测中的序列特征靶向区分miRNAs成员的区域，泛应用于核酸检测。由于生物化学的繁荣发展，SQ-PCR很轻易地就可发展为用于定量任何序列，从而也适用于高通量地灵敏定量已经证实的和推测出的miRNAs。18-40nt）的smallRNA进行高通量。继而通过数据库比对进行信息分析。包括文库构SmallRNA为全面了解某组织在特定状态下的smallRNA组成和功能提供了契机，miRNA角度理解、解释相关生理过程奠定了基础。但为了更科学的从多角度同时解释相关生理过程，smallRNA还可与数字表达谱