浅析基质细胞衍生因子在哮喘小鼠气道中的表达的论文

浅析基质细胞衍生因子在哮喘小鼠气道中的表达的论文【内容内容摘要】目的观察基质细胞衍生因子-1(stromal-derivedfactor-1,sdf-1)在鸡卵清蛋白(ova)诱导小鼠哮喘模型中的表达，探索哮喘气道重塑的发生机制。方法40只雌性spf级c57bl/6小鼠，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法建立ova小鼠哮喘模型。两组动物于末次雾化结束后24h处死，取肺组织行病理切片，苏木精-伊红染色(he)观察肺脏的组织病理学变化;逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、免疫印迹法(westernblot)、免疫组织化学(immunohistochemistry,ih)技术检测肺组织sdf-1的表达。结果①哮喘组支气管上皮细胞脱落、气道壁增厚，细支气管和血管周围有大量炎细胞浸润;②哮喘组肺组织sdf-1在rt-pcr、westernblot及ih中均为阳性表达，而对照组则否。结论小鼠哮喘时肺组织分泌大量细胞趋化因子sdf-1，可能是哮喘气道重塑的重要因素之一。【本文本文关键词语语】基质细胞衍生因子;哮喘;气道重塑abstract:objectivetostudytheexpressionofstromal-derivedfactor-1(sdf-1)intheairwayofmicewithallergicasthmainducedbyovalbumin(ova)soastoexplorethemechanismofasthmaticairwayremodeling.methodsfortyfemalec57bl/6miceofspfgradewererandomlydividedintoasthmagroupandcontrolgroupwith20ineach.miceweresensitizedandchallengedwithovalbumintoestablishtheasthmaticmodel.allthemicewerekilled24hoursafterthelastaerosolisation.theparaffinembeddedsectionsoflungtissueswerestainedwithhematoxylinandeosin(he)foranalyzingpathologicalchanges.sdf-1mrnaextractedfromlungtissueswasassessedbyrt-pcrwhilesdf-1proteinextractedfromlungtissueswasassessedbywesternblotandimmunohistochemistry(ih).results①afterrepeatedallergenchallenge,obviousinfiltrationofinflammatorycellsandproliferationofgobletcellsandsmoothmusclesappearedinmousebronchi.②accordingtort-pcrandwesternblotandihresults,theexpressionofsdf-1waspositiveinasthmagroupbutnegativeincontrolgroup.conclusionalargeamountofsdf-1issecretedinthelungtissuesinasthmaticmice,whichmaybeoneofthecriticalfactorsinasthmaticairwayremodeling.keywords:stromal-derivedfactor-1;asthma;airwayremodeling支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，而气道重塑则是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程。11665.Com基质细胞衍生因子-1(stromal-derivedfactor-1,sdf-1)是由基质细胞产生的一种cxc型趋化因子。近年来研究表明，基质细胞衍生因子对组织或器官的创伤、炎症损伤修复起到了重要的作用。但是，sdf-1与哮喘相关性的研究当下还未见报道，我们就此进行了探讨。1材料与方法1.1药品与试剂鸡卵清蛋白(ova)ⅴ级(美国gbico公司);氢氧化铝干粉(郑州派尼化学试剂公司);pbs(美国gbico公司);sdf-1兔抗小鼠一抗(武汉博士德生物);过氧化物酶标记羊抗兔二抗(美国dako公司);ecl发光液(北京碧云天公司);兔抗小鼠内参β-actin(北京博奥森公司);免疫组织化学试剂盒(美国dako公司)。1.2方法1.2.1哮喘模型的制备小鼠哮喘模型实验以下为以下为参考文献[1]，略有变动。实验动物为40只雌性spf级c57bl/6小鼠(第四军医大学动物中心提供)，体重18～22g，随机分为哮喘组和对照组。按照文献方法[1]构建哮喘模型：0、7、14d于小鼠腹腔内注射致敏液0.2ml/只(致敏液为每0.2mlpbs溶液内含10μgova、20μg氢氧化铝)。于第21天开始0.5g/l浓度的ova生理盐水溶液雾化，每次30min，隔日1次，共计18次。对照组用空白pbs及生理盐水，余同模型组。两组动物于雾化结束后24h处死，取右肺于40g/l甲醛溶液中固定，石蜡包埋，用于病理观察及免疫组织化学(ih)检测;取左肺于液氮中保存，用于rt-pcr及western-blot测定sdf-1。1.2.2rt-pcr法检测sdf-1的表达提取肺组织总rna，分光光度仪上定量及检测rna纯度，用两步法rt-pcr。sdf-1上游引物：5′-cactttc-actctcggtccac-3′，下游引物为：5′-ctgaag-ggcacagtttggag-3′，序列长度约500bp。pcr反应条件：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。rt-pcr产物以10g/l琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在gds-8000数码成像及分析系统上观察、拍照。1.2.3westernblot法检测sdf-1的表达左上肺组织用液氮粉碎及超声提取总蛋白后，每组取400μl总蛋白，加入等体积的2×sds凝胶加样缓冲液，100℃5min使蛋白变性;经120g/lsds变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转印至pvdf膜;50g/l脱脂奶粉封闭后，sdf-1兔抗小鼠一抗(1∶200)及兔抗小鼠内参β-actin(1∶200)孵育4℃过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2h后，ecl试剂进行检测，在flourchemfc2成像及分析系统中观察、拍照。1.2.4免疫组织化学法检测sdf-1的表达哮喘组及对照组肺组织蜡块连续石蜡切片，经脱蜡至水后以0.3ml/l过氧化氢溶液浸泡10min，灭活内源性过氧化物酶;抗原热修复后以正常山羊血清封闭，分别加一抗即兔抗小鼠sdf-1抗体1∶200，4℃过夜;加生物素标记的二抗(羊抗兔igg1∶200)，37℃，40min;加新鲜配制的二氨基联苯胺(dab)显色，苏木精复染细胞核，显微镜下观察5～10min，棕黄色染色为阳性信号。1.3统计学分析应用spss16.0软件包行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，采用两样本t检验处理统计学数据，p0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1小鼠的一般情况及肺组织病理学改变哮喘组小鼠经激发后，出现烦躁不安，呼吸急促，腹部翕动，易激惹;对照组小鼠行动敏捷，一般情况未见异常。哮喘组小鼠肺组织切片he染色可见，小鼠细支气管周围和血管周围有大量的淋巴细胞、单核细胞和多形核细胞浸润，并伴有上皮脱落，气道壁增厚。对照组病理切片无上述表现(图1)。图1小鼠肺组织的病理学改变fig.1hestainingoflunghistologicalsections(he,×100)a：对照组;b：哮喘组。2.2rt-pcr琼脂糖凝胶电泳结果哮喘组于500bp处出现特异性扩增条带，与预期趋化因子sdf-1扩增片段一致;对照组无特异性扩增条带。正常肺组织几乎无sdf-1mrna，哮喘时肺组织有sdf-1mrna(图2、表1)。图2rt-pcr法检测两组小鼠肺组织sdf-1mrna的表达fig.2theexpressionofsdf-1mrnainasthmaticmouselungtissuesonrt-pcrm：蛋白分子量标准;1：哮喘组;2：对照组。表1两组小鼠肺组织sdf-1mrna的表达2.3westernblot化学荧光法的检测结果哮喘组于15ku处有特异性条带显像，与sdf-1蛋白分子质量一致;对照组无特异性条带显像。正常肺组织无sdf-1蛋白表达，哮喘肺组织表达sdf-1蛋白(图3、表2)。图3westernblot化学荧光检测两组小鼠肺组织sdf-1蛋白的表达情况fig.3theexpressionofsdf-1proteininmouselungtissuesonwesternblot表2两组小鼠肺组织sdf-1蛋白的表达2.4免疫组织化学(sabc)法的检测结果哮喘组可见支气管上皮细胞破坏，支气管和血管周围有大量炎细胞浸润，支气管壁及周围大量细胞于胞质内出现棕黄色阳性信号;对照组无上述病理变化，无棕黄色阳性信号出现(图4)。图4小鼠肺组织sdf-1表达的ih化学检测fig.4immunohistochemistystainingoflunghistologicalsections(sabc,×100)a：对照组;b：哮喘组。3讨论sdf-1是由基质细胞产生的cxc型趋化因子，有sdf-1α、sdf-1β，sdf-1γ三个亚型。cxc族细胞因子受体4(cxcr4)是当下所知的sdf-1的唯一受体。sdf-1基因5′末端存在丰富的gc序列，而tata序列则极少表达。sdf-1在各物种中有高度保守性，在人与鼠的sdf-1的氨基酸序列中有95%是相同的[2]。支气管哮喘是一种慢性气道炎症，伴有气道高反应性和气道重塑，气道重塑是哮喘难以治疗的主要因素之一。因此，防止或减轻气道重塑也就成为防治哮喘的重要策略，是呼吸领域备受关注的热点问题。我们采用rt-pcr、westernblot方法检测到哮喘肺组织高表达sdf-1。进一步采用免疫组织化学方法，发现sdf-1蛋白质主要分布于支气管壁及周围细胞的胞质内。近年来研究发现，在多种组织损伤修复过程中均有sdf-1的参与。例如，当心[3]、脑[4]、肝脏[5]、肾脏[6]等组织器官损伤时，病灶内sdf-1的分泌量显著增加，促进了纤维组织增生和新生血管形成。在博来霉素诱导的肺间质纤维化小鼠模型中，肺组织高表达sdf-1与肺纤维化有密切关系[7]。气道重塑的本质是一个在慢性炎症基础上的异常损伤修复过程，因此我们推测：在支气管哮喘导致气道重塑的过程中，肺部损伤释放趋化因子sdf-1可能在支气管哮喘气道重塑中起重要作用。现有的研究表明，sdf-1与组织损伤的修复有着密切的关联，但其是否在哮喘气道重塑中起到作用，还需要做大量的研究。希望以此为切入点，为治疗支气管哮喘、防止或减轻气道重塑寻找到新的、更为有效的方法。【以下为以下为参考文献】\[1\]temelkovskij,hogansp,shepherddp,etal.animprovedmurinemodelofasthma:selectiveairwayinflammation,epitheliallesionsandincreasedmethacholineresponsivenessfollowingchronicexposuretoaerosolisedallergen\[j\].thorax,1998,53(10):849-856.\[2\]murdochc.cxcr4:chemokinereceptorextraordinaire\[j\].immunolrev,2000,177:175-184.\[3\]kuciam,dawnb,huntg,etal.cellsexpressingearlycardiacmarkersresideinthebonemarrowandaremobilizedintotheperipheralbloodaftermyocardialinfarction\[j\].circulationres,2004,95(12):1191-1199.\[4\]imitolaj,raddassik,parkki,etal.directedmigrationofneuralstemcellstositesofcnsinjurybythestromalcell-derivedfactor1alpha/cxcchemokinereceptor4pathway\[j\].procnatlacadsciusa,2004,101(52):18117-18122.\[5\]dalakase,newsomepn,harrison