生殖免疫学书稿已zp与避孕

第章Short60299060亿，估计到本世纪末可能还将再次翻番，虽然一些人口统计学家认为在那时会停。维持时间长但可逆、价廉和方便使用以及不涉及侵袭性外科手术等的研制无疑能符合这些目标，因为此类有可能提供半年乃至一年较长时期抗作用，可间隔使用，并可融入存在于大多数发展中国家分发抗疾病的服务机构，便于推广应用。如果能成功地筛选到一系列生殖。 考虑到上述这些优点，如图X-1所示，上世纪70年始的研究主要围绕前后二条途径展开。以人绒毛膜促激素(hCG)为代表的后抗途径，因涉及前途径的抗和抗的研究。1932年，Baskin应用新鲜注入妇女体内，引起育长达一年之久，第一次揭示了免疫可致不育的事实。70年代初，Shivers等人则用动物免疫雌性仓鼠，发现抗抗能在体外抑制仓鼠的，并能封闭对的作用。随后发现用机体组织吸收抗抗后，所剩的抗体仍能沉淀于卵透明带(zonapellucida,ZP)表面，并抑制精卵结合，从而证明抗抗的抗作用主要由抗ZP抗体所引起。由此揭开了抗ZPZP形成、它的组成和结构、各组份生物学功能、抗原性、免疫原性和自身免疫疾病发生机制的研究，以及作为一种免疫靶抗原的潜在可能性和研制新策略的概述第一节发就产生雌性配子和为它们有序发育提供必需的内分泌支持这两方面能力而言哺乳动物在分泌中是独特的这些功能利用了生殖活动期间涉及下丘脑和脑垂体前叶的复杂反馈机制，以往大多数研究都一直聚焦于恰恰是前的发育后期阶段但为了弄清楚免疫学方法干扰卵巢功能的基础，有必要研究发育最初的几个阶段。人雌性胚胎的原生殖细胞在约24天时就能被辨认。虽然在从卵黄囊的后壁向预定开始它们的迁移时约有100个生殖细胞，但到发育5个月时，减数使它们在内增加到7百15～75始外胚层而来但它们的确切和出现时间不清楚首先作为生殖嵴(gonadalridges)出现，而这些原生殖细胞独特地向生殖嵴进行漫长且复杂的迁移，在那里增殖(交尾后11天可达到2，600～5，700个)并集聚在发育中。在小鼠中，交尾后10天原尿殖嵴开始形成中肾后部，并12.5组成的发育完全的最近的研究表明体腔上皮开始分层使发育的微小突出形成体腔体在基底通过性索膨大和髓质形成向周缘位移)的这初级性索中断成含原生殖细胞群的不规则簇团(clusters)，然后它们分化成可产生细胞的“发生”性索。这些聚簇随后被形成髓质的维管基质所取代。此外,最近的研究还显示在猪和兔发育中层粘连蛋白(laminin)形成与包绕卵囊巢上皮接连的表面上皮基底室的基质。合起来看，多数提示发育的一些远祖上皮细胞也许是表面上皮的后裔。常不会被免疫系统识别为外来异物。与此相反，雄性减数直到才开始，因而在载体内发育的一般被免疫系统作为异物识别第二节生数处于某一萎缩期的有腔大。在此发生的起始阶段似乎不依赖于促激素。但是，发育的最后14天都处于与下丘脑-垂体轴一致的内分泌控制之下细胞的生长和成熟与颗粒细胞和膜细胞的分化同时进行而结局是在人类中通常有一个成熟卵细胞或成熟的也许涉及正常发生。在早期生成和发育期间形成胞外基质――ZP。，颗粒细胞分化和增殖细胞同步生长成熟，直到萎缩或成熟为可产生一个能生存卵细胞的ZP蛋白抗也已证实了性成熟猴和人中ZP抗原的表达。，ZP基质的形成受发育调节，因为它出现在分化时发生的生成特殊阶段。由于兔发育被延出生后，所以兔被认为是研究生成早期阶段的一个极好模型。2只含有ZP基质的块状沉积，到第8周前后存在带生长ZP基质的次级和早期有腔。这些最初的有腔用外源促激素并不能诱导。到12周左右，外源FSH能发动可的募集和。用免疫组织化学方法确证了兔R45和R55两种ZP蛋白在性成熟中的发育表达。在2原始的细胞中首先能检测到R55蛋白。一旦原始已发育成初级，R45和R55则被定位在细胞和颗粒细胞上先用啮齿类动物的研究已将细胞鉴别为ZP蛋白的唯一来源，包括仅在人和仓鼠的此争论问题的水平，将在ZP的分子生物学一节中论及。第三节哺乳动物ZP是包绕生长细胞、排出和胚胎的一层半透明丝状体酸性糖蛋白。ZP特征一直是ZP研究的重要内容之一。在小鼠中，静止细胞为不存在ZP，而在它进入2周生长期之前也检测不到ZP蛋白合成。在生长期阶段细胞合成ZP蛋白并分泌形成ZP带基质然而在生长完全的细胞中带蛋白合成下降，在排出中检测不到带蛋白合成。一旦被分泌并结合成ZP带，那么小鼠带蛋白就具有100 猪185～120～ 83～ 兔85～95100～ 68～120人90～64～ 57～ZP上。1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)PAGEZPZP1ZP2ZP3(兔ZP蛋白名属例外)猪ZP的情况比较复杂早先还原条件下的SDS分析凝胶上显示ZP1、ZP2、ZP3ZP4ZP1ZP3βZP3蛋白，证实它是由一级结构明显不同的两种糖蛋白通过寡糖链连接而成ZP3αZP3βZP蛋白就似乎有了五种糖蛋白组份。ZP到底由几种糖蛋白构成的困惑。尽管那时已有资料表明猪ZP2和ZP4是ZP1的断裂产物但对此困惑的最终释疑还是在克隆了猪ZP1之后即Hasegawa等和Taya等分别在水平证实猪ZP2(氨基酸残基数548)和ZP4(133)确实源自ZP1(713),含推35个残基信号肽)。从表1中可看出以往的ZP多少有点，而且依据电泳迁移率名也确，资料表猫、狗、牛、猴等越来越多物种全部三个ZP编码的克隆，有人建议将三个ZP蛋白按所克早先ZP命名出现，这也许是为叙述和过去文献的方便。表2按大小的ZP蛋白组份命名和与人ZP对应组份的同一性比ZP物 (新命名 人- (新命名 人- (新命名 人-起始原由一个被一层成纺锤形的颗粒细胞包围的细胞(10～15m)组。当细胞进入它的2周生长期时，颗粒细胞增殖并形成立方，随后或是分化成依附基底膜的壁细胞或是分化成与生长细胞紧密相连的卵丘细胞在生长期结束时70～0μm的细胞被一层7μm的ZP包围外面还有几层颗粒细胞。ZP是一能通透大分子和一些的高度多孔状结构其含3～4ng白约占细胞总蛋白的17％小鼠P的子显微镜图表明三种ZP2～3μmX2A)7～18nm，9nmZP2/ZP317nZP1X2)。X-2ZPAZPZPZP结构模型，还B-细胞表位(B-cellepitope,过去称抗原决定簇)。但由于众所周知的原因，早先一直难以对它们进行直接的蛋白质生化分析。随着各物种全部ZP蛋白编码的相继被克隆目前已能在水平间接了解ZP蛋白的一级结构包括它们各自的氨基酸组成和排列顺序、NO-连接糖链数、二硫键数目和定位、分子水缘性(hydropathicity)情况、以及α螺旋和β折叠ZPZP第四节体，然后ZP与质膜融合。完整进入卵细胞浆，在那里它的核DNA被解聚，之后与在真哺乳动物中，ZP是精卵识别和结合的最重要因子之一。这识别过程的重要性在于它的细胞和物种特异性。人不会同类人猿以外的任一物种ZP结合，而在运行期间除同雌性生殖道内上皮表面细胞有短暂接触外，也不会与细胞以外的任何类型细胞反应结合。ZP3–ZP的第一受体，ZP3β在体外测定中虽然不能与膜结合，但可增强ZP3α与膜结合。Tsubamoto等不久前证明对应氨基酸顺序1-206的重组人ZP2(ZPA)蛋白可结合反应过的，而且其抗体抑制了人结合和进入人ZP，从而提示人ZP2在人类中也具有第二受体结合无关。但最近有文献猪ZP1(ZPA)也涉及结合，这意味着三个ZP组成蛋白和/或其肽片段都有可能成为抗结合的一个免疫原。表3是到目前为止这方面研究的一个归纳3ZP 小鼠 小鼠--猪+

小鼠 猪 注：ND,未确定;＋,第二受体。根据Prasad等的归纳修改ZP3分子负责参与精-ZP3先参与识别。ZP表面拥有被大量糖基化的寡糖链触角，其功能就是诱捕游动并予以定向，以致能结合并ZP基质在小鼠中与ZP3特异的O-连接寡糖末端的半乳糖残基结合，末端的甘露糖残基。在对ZP起始吸附或粘附之后，对ZP的紧密结合似乎是糖类-糖类、糖二、的反应诱导和向前运动和可能的趋化因子吸引，5～10个穿过的外层卵丘。紧接着同ZP的结合似乎分二步进行，即，先是通过头部与ZP受体的前质膜(anteriorsmamembrane)相互反应形成对ZP的松散附着，之后不受任何干扰地产生紧密结合。期间，定位在头部的一种膜结合细胞器――开始发生反应，以释放水解蛋白酶(酶和糖苷酶)打开ZP通道，使正在的得以ZP抵达卵周隙，进而发子膜与卵膜的融合。在反应之前，内外膜融合产生内容的胞吐作用有实验证明诱发此反应的正是ZP中的第一受体ZP3，因为纯化自小鼠未卵的ZP3可在体外诱导反应，而ZP1、ZP2和来自两细胞的ZP3均无此能力。纯化的小鼠ZP3蛋白经酶消化并不影响受体活性，但破坏了它诱导反应的能力，这说明完整多肽主链的维持，对能诱导反应的众多糖类侧链的空间正确定向至关重要。使用重组人ZP3的一些研究也已表明仓鼠细胞表达的糖基化和细菌表达的非糖基化(与GST融合)ZP3蛋白都能诱导人的顶体反应，前者可使人同仓鼠ZP融合。此外，处于状态的附近还存在许多其他分子，其中孕酮也有经其他信号传导途径诱导反应的能力。在反应早期，孕酮起预先激发作用，然后与ZP3协同诱发反应。三、后多精入后马上出现预防多精入卵的两个重要变化：一是卵质膜的快速电去极化作用(electricaldepolarization),以使卵周隙中的其他不能与融合；二是阻碍另外结合的ZP生物化学小鼠ZP2被认为是的第二受体它参与后阶段精卵相互反应包括它同膜表达的酶的结合，以维系ZP期间精卵的密切接触。在后立即出现的ZP生化修饰机制中，ZP2被蛋白酶裂解使其他失去对带的亲和性以致其他已进入ZP的不能继续进行。另外，ZP3也被修饰而不再具有受体活性和反应诱导能力。后ZP蛋白的稳定性质，保证了ZP在结构上依然完整，使得的胚胎在着床前能顺利地通过。一旦ZP受损或脱落，胚胎就无法在中蠕行过程中存。体外培养小着床前胚胎时，胚泡外的ZP脱落也许与胚胎内一种被命名为“”(strypsin)的蛋白酶相关。虽然ZP的生化修饰作用和归因于胚胎生长的机械性影响，都有助于胚泡从ZP中及时释第五节从1986年克隆小鼠ZP3第一个起，到小鼠ZP2和ZP1的克隆鉴定，历时整10年。哺乳动物ZP的克隆，为了解和比较它们的转录物、蛋白一级结构及其同源性提供了大量列资料库中的非ZP核酸和蛋白也无明显的顺序相似性，但在哺乳动物各ZP成员之间，它们的外显子组成，编码区长度以及核苷酸序列存在相似性（如ZPA的小鼠和人ZP2的同一性为70％，ZPC的小鼠和人ZP3的同一性为74％，都是非常保守的。和O-连接糖基化位点羧基端跨膜区都存在疏水区段所编码蛋白的氨基酸顺序相似性（小74％。和人ZP亲缘关系近，与猪和兔相对较远。这同源性在哺乳动物同一目中显示最高，例如猪和似性。小鼠ZP1明显长于兔R55，它们同属ZPB，但核苷酸同源性之低可看作例外。这两条多肽链中连续可比较的427个残基中，尽管225个残基具有66％的相似性，但总的相似性仅先前大量的ZP抗试验证实，抗ZP抗体与分离自脑、心脏、肝、肾、脾和组织的抗cDNA大小一致。作为对照组，用同位素标记的肌动蛋白cDNARNA印迹杂交，在上述六种组织都检测到了它的转录物。ZP表达定位于内哪一种类型细胞？这是又一个令人感的问题,因为早先在蛋白质水平的这方面研究曾有不同的结论(见生成一节)。Epifano等将13日龄小鼠作固定组织能检测到它们各自的ZP转录物（散在于胞浆中；在静止细胞中仅看到ZP2的杂交信号；在颗粒细胞中未检测到这些转录物。因此，作者认为小鼠ZP的体内表达仅限于卵Dunbar等通过RNA印迹分析证明在体外培养的颗粒细胞中存在兔R55转录物而另一兔细胞的情况下兔R55在生长颗粒细胞中不受阻遏而得以表达段崇文等也有类似的实验结果和解释，即小鼠细胞在生长前期合成ZP3，后期合成减弱而由颗粒细胞开始合成和分泌ZP3。~15m）ZP2转录物，不过还难以判断这一检测是反映其丰度（例如，ZP1ZP3转录物也同时存在，但含量在所用测定方法的灵敏度之下还是ZP2表达在先。当细胞开始生长时，三种转录物同时出现并逐渐累积，到发育成中等大小细胞（50~60m）时达到最高水平，约占总多聚（A）＋mRNA的1.5%。其后随细胞成熟（75~80m）而下降，在排出小鼠ZP被协同表达，而且是细胞（或许还包括颗粒细胞）特异的，因而它们的表达有可能受一些共同的调节因子控制。小鼠和人ZP2和ZP3上游最前面的300个碱基对（bp）54~12bp的保守元件，它们位于转录起始位点远端的距离大致相当，经片段缺失或碱4ZP2ZP3基因的5’-和3’-端非编码区都极短，但这一特征在ZP表达机制中的作用或意义还不清楚第六节有鉴于哺乳动物ZP的组织特异性、高免疫原性及其参与过程中许多重要环节因此从八十年代前后正式开始研制起，ZP就被普遍看好是抗的理想靶抗原，并由于人的不可获得性和实验研究的约束，因此限制了直接用人ZP乃至它的三个蛋白组份开展相关抗研究。于是早期的相关尝试都集中在使用其他哺乳类物种的ZP上。虽然用抗小鼠ZP抗以及抗大鼠ZP2和ZP3的单克隆抗体(单抗)对小鼠进行免疫，可发现这些抗体能特异性地结合到小鼠细胞ZP上并通过ZP而产生长期且可逆的作用。ZP2ZP3B-细胞表位在其他哺乳动物中不存在，所以不可能将鼠类ZP用作其他物种的抗原早期研究也表明用天然兔ZP免疫接种兔的场合，体内无抗体生成，而且免疫兔依然保持力。在这种情况下，兔ZP从一开始就被排除在人用候选ZP原之外。当年最被看好的人ZP可能的替代物是猪ZP免疫原，这不仅是因为可从屠宰场方便地获得大量的猪，进而分离纯化到足够量且价廉的ZP抗原，更重要的是抗猪ZP抗体可与人和松鼠猴ZP发生交叉反应，并在体外抑制人精卵结合。尽管为此展开了用猪ZP免疫原的大量抗研究，然而近年来猪ZP1、ZP3α和ZP3β的抗原B-细胞表位鉴定结果表明，它们的ZP相应蛋白上不存在，或存在非常接近的表位序列(相差一个氨基酸残基)，但开展相关的实验，其突出的优点还在于该动物模型更便于评价ZP的功效。ZP蛋白免疫大鼠和小鼠对不育无效，但对兔、狗和灵长类等雌性动物模型进行免疫接种，都能产生免疫反应，并造成阻断,而且这抗效应与ZP抗体相关，随着抗体水平的下降而恢复力。用ZP蛋白接种，被免疫动物几乎都能导致与ZP结合的抗体生成，因此抑制。用抗ZP抗预处理，在包括狗、仓鼠、小鼠、大鼠、松鼠猴、人类和兔等大多数物种中都阻断了体外精卵结合。Sacco等在猪物种中做了这样一个研究，即将公猪与纯化的猪ZP3α先进行预温育一段时间，结果两者先相互反应的结果抑制了随后对天然猪ZP的粘附，而将含ZP的细胞与抗猪ZP3α抗预温育，则抑制了随后的猪对卵的吸附。这实验既证实了猪ZP3α蛋白是猪第一受体，也清楚地反映了抗ZP3α抗体在抑制精卵反应中的作用。另外，Dudkicwicz等也还发现兔抗仓鼠的抗能通过沉淀在仓鼠卵ZP上抑制受精卵着床。根据这些体外实验结果，一般认为ZP抗的机制可能体现在两个方面：1.ZP抗体封闭了ZP中的受体部位，导致精卵结合受阻；2.抗体促进了ZP表面结构的稳，从而阻碍酶对ZP的定点水解消化，造成ZP难以进行，抑或这一ZP结构稳，使胚泡难以冲破ZP包围而不能着床。也有人认为体外精卵抑制反应未必归应于抗受体特异抗体的作用，因为可阻断结合的抗小鼠ZP抗体被转换为Fab片段后未能显示任何效果，他们提出位阻现象(sterichindrance)，即抗体结合在受体附近的位点而堵塞受体，可能是抑制精二、透明带的免疫病理现原始细胞库渐进衰竭而造成类似早期绝经的情况。ZP免疫后所有这些组织病变和哺乳类物种中尝试使用天然ZP蛋白，但破坏功能和引起持久不育，对人类显然是不可接ZP3β蛋白免疫狨猴依旧观测到发育休止，改用化学方法纯化的猪ZP3和表达后纯化的重卵的抗体，不过这些实验结果仍有待进一步论证。图图X-3ZP造成小鼠自身免 ZP3生自身免疫炎的小鼠中它们的CD4+T-细胞和抗，然后分别注射未免疫过的小鼠，发现接受T-细胞注射的小鼠都过继性地被诱发了病变症状，而接受抗的小鼠则均无炎症TX-3上一外源T-细胞表位免疫后也都激活了T-和B-细胞应答但与前者相比却无病理症状。ZPTCD4+TZPZPT实验结果在ZP研究领域产生了广泛的影响，因为它们解决了ZP研制中两个长期困惑的问题：一，ZP抗体干扰精卵是否必然影响正常的功能？二，ZP免疫对的损伤性干扰能否克服？因为它们也展现了今后ZP发展的一个可能的方向。为若能检测到它的存在，又无明显的功能变异症状，可进一步确认研制ZP的合理性和可行性，而且目前也已具备用重组人ZP蛋白去筛选甄别此类不育女例的可能性。过去偶而也有若能最终找到这样的变异妇女并获得她们的抗，对于鉴定可导致的人ZP抗原若干B-细一组份蛋白及其它们部分酶解肽段都不能解决ZP免疫造成功能异化的情况下，以ZP抗原中B-细胞表位为靶标，发展ZP化学合成肽以及嵌合肽也就成了新的必然选择。小鼠ZP合成肽研制化学合成肽的前提是，首先要知道目的ZP蛋白中关键的B-细ZPB-细胞表位鉴定奠定了基础。ZP3DNADNA2001000碱基大小不等的片段，并将它们重组插入gt11表达载体，然后用有明显抗效果的抗ZP37B336-343(FQIHGPR)。图图X-5小鼠 亚克隆表达的B-细胞表位鉴ZP3B-细胞表位N16328–343，并通过合成NT(Th)细胞表位的钥孔血兰蛋白(KLH)偶联，然后使用福氏佐剂，以100gZP3合成肽-KLH偶联物的剂量，经腹膜免疫16只远交系CD1雌性小鼠，间隔10–14天再增强免疫一次。结果产生的抗ZP3抗可与天然ZP以及实验小鼠和解冻小鼠中发育细胞外层ZP结合，但与小鼠脑、肝、脾、肾、心脏、肺、等组织无反应。更果十分令人鼓舞，因而后在ZP研究领域产生了广泛的影响，尽管此ZP