靶向测序覆盖度优化

为了最大程度地提高靶向重测序的研究效率，并确保高度敏感突变检测获得足够的覆盖度，应考虑三个关键因素：1、目标区域的总长度；2、富集效率（readspassingfilte百分比及mapping百分比）；3、目标区域覆盖深度范围；靶向测序覆盖度优化将测序覆盖率定义为与已知参考碱基比对的平均读取数即：numberofreadsxreadlength/targetsize目标区域的总长度靶向区域的总长度等于富集分析中靶向的基因组序列的总长度（bp）。例：TruSeqExomeEnrichmentKit靶向测序总长度：62Mb（（包含：5'UTR,codingexons,3'UTR,microRNAs，microRNAtargets,andotherselectedandconservedregionsofinterest）95mer探针捕获300–400bp文库（插入片段180–280bp），文库大小350bp靶区域150bp插入片段230bp60bpadapters60bpadapters95mer探针65的readsmap到靶区域当350bp的DNA文库（插入片段=230bp）被生物素化TruSeq探针富集，每个探针都会拉下整个文库

每个95mer探针均靶向目标区域，保守的假定探针需要与插入片段（230bp)的95个碱基全部杂交，插入片段最左侧位置为探针最右侧位置上游的230bp处，插入片段最右侧位置为探针最左侧位置下游230bp处。则：Pulldown=2*Insert–Probe=2*230–95=365bp。根据经验证据表明80mer的探针内最多可容许15个错配，意味着探针拉下的区域可能会更大，上述为保守估计。虚线表示富集片段的覆盖深度，超过65的过滤Reads被映射到参考基因组上将overlap靶区域，超过80的过滤Reads被映射到靶区域中的150个碱基上。探针拉下的365bp的序列对称地集中在探针的中点上。每个95mer探针通过平衡GC组成和特异性来针对TruSeq外显子组靶标设计。红色方块显示了一个转录本的子集。蓝色细线表明每个探针间的最佳间隔距离。热图反应了测序深度。最大的外显子区域被22个探针均匀覆盖，覆盖深度为50×~150×。富集效率靶向区域的总长度等于富集分析中靶向的基因组序列的总长度（bp）。对6个样本进行TruSeq外显子组富集实验，仅考虑mapping到62Mb的靶向区域，可获得约70％的富集效率。由于TruSeq富集技术的特性，实际被测区域的上游和下游的加垫区域也被捕获。当reads扩展到目标区域+/-150bp(117.5Mb)时，观察到富集效率从>65%(蓝色条)增加到>80%(紫色条)。因此，研究人员可以用最少的探针来获取最大数量的DNA，同时也可以获取任何给定目标附近的序列，从而获取可能难以通过竞争技术（competingtechnologies）获取的区域的生物信息。

靶区域的覆盖深度简单地计算平均测序覆盖率将只提供富集样本靶区域一个摘要平均读深度。应报告特定测序深度下覆盖目标碱基的给定百分比(例如，10×读深度下覆盖90%的目标碱基)。可以通过对样本进行过度测序以增加总测序覆盖率，但是，这是一种非常低效的方法。ADCBCreationofaTruSeqNormalizedMeanDistributionPlotTruSeqExome覆盖图归一化脚本/计算所需的测序数据量通过如下步骤，可以确定为一定比例的碱基获得指定覆盖度所需的测序量90。Step1

如前TruSeqExome90的碱基预期10X则需要：Step2RequiredamountofPFmappedsequence：

如TheTruSeqExomeEnrichmentKit：需要4.8Gb的测序数据才能获得90％的目标碱基的10X覆盖率。Totaltargetedbases=62MbMean