支原体检测方法

支原体检测方法汇总一、培养法二、荧光指示细胞法三、PCR法四、扫描电子显微镜法目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。一、培养法培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。（一）材料与设备精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20%胎牛血清）。支原体琼脂培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20%胎牛血清）。其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37C培养箱。（二）操作步骤样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h以内进行支原体检测，可储存在2~8C;如果超过24h样品应放置于-20°C以下保存。-20C保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h后，取上清直接进行接种检测。准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。将样品分别接种到10ml精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36C）,每支培养基接种样品0.5~1.0ml.每种样品接种6支精氨酸肉汤培养基，3支半流体培养基。接种6d后，取3支精氨酸肉汤培养基中样品0.5~1.0ml.复种于精氨酸肉汤培养基中。5.36C培养29d，每隔3d观察一次。记录实验结果。（三）结果判断培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色）。半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀二、荧光指示细胞法荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA中富含A-T的区域，由于支原体的DNA中A-T含量占多数（55%~80%）,所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA,证明该细胞有支原体污染。（一）材料与设备荧光显微镜。2.CO2培养箱。3.无菌小爬片。4.无菌培养皿。不含抗生素的完全培养液。二苯甲酰胺荧光染料浓缩液（50^g/ml）。称取5mg二苯甲酰胺荧光染料加入1ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中，在室温下用磁力搅拌30~40min，使完全溶解，-20。避光保存。二苯甲酰胺荧光染料工作液（0.5^g/ml）。取1ml上述浓缩液，加至1ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液中，终浓度为0.5^g/mlo固定液，即乙酸：甲醇（1:3）溶液为细胞固定液。封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml,0.2mol/LNa2HPO4・12H2O27.8ml,丙三醇50.0ml,以上三者混匀，调pH至5.5。不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO细胞。（二）操作步骤无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。VERO细胞爬片：将爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO细胞悬液（细胞浓度约3x104个/ml）2~3ml,置于CO2培养箱内培养24h使其贴壁。制备标本。向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h后（VERO细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。漂洗一将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO3的Hanks溶液（或PBS）漂洗3次。固定一用乙酸：甲醇（1:3）固定液固定10min。漂洗一待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。染色一置于Hoechst33258工作液（0.5^g/ml）中染色10min。漂洗一去离子水中漂洗3次，每次1~2min。封片，紫外激发，观察。（三）结果判断当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效。阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。阳性结果荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。（四）小结严格配制工作液及封片液。保证作为指示细胞的VERO细胞没有被支原体污染。必须同时设立阳性及阴性对照，注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。4.应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。5.可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。三、PCR法PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑样品要经过3次PCR检测，或用培养法检测。PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增实验，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格，实验成本较高，有时还会出现假阳性的现象。（一）材料与设备支原体PCR检测试剂盒、dNTP、Taq-DNA聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。（二）操作步骤样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液5ul,4C保存待测。模板的制作。在无菌的条件下，取细胞培养上清1ul于无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子，95C水浴加热5min。打开盖子，向管内加StrataCleanResin10ul，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5~10s,吸取上清至一新的塑料离心、管中，模板制作完毕，4°C保存。PCR反应。反应体系适合条件为10mmol/LTris-HCI（pH8.38）