第六章植物原生质体融合技术黄秀梅

植物原生质体融合基本过程当前1页，总共53页。当前2页，总共53页。◆Why技术应用植物原生质体融合的意义：◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件当前3页，总共53页。◆How植物原生质体融合技术方法植物原生质体的制备植物原生质体的培养植物原生质体的融合当前4页，总共53页。1、原生质体的概念及培养的意义2、原生质体材料来源3、原生质体的分离4、原生质体的纯化当前5页，总共53页。概念：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体当前6页，总共53页。★植物叶片－取材容易－比较容易用酶解法分离★植物根尖组织－可由各种植物的种子萌发后取得★植物花粉－产生单倍体原生质体★愈伤组织、悬浮培养的细胞－细胞壁容易解离当前7页，总共53页。当前8页，总共53页。当前9页，总共53页。当前10页，总共53页。当前11页，总共53页。例:烟草叶肉细胞原生质体的分离1).材料的准备与消毒：2).酶解：3).纯化：4).原生质体的活力测定当前12页，总共53页。1).材料的准备与消毒选取在温室中生长两个月左右的烟草植株从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片经自来水冲洗干净后放入70%乙醇中进行表面消毒然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂当前13页，总共53页。2).酶解

用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮，将叶片切成2cm长的小片，然后放入含酶溶液中处理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，温度25～28℃下经3-4小时的酶解反应，其间轻轻摇动培养皿若干次）当前14页，总共53页。3).纯化

将酶解悬浮液通过300-400目网，以除去大的未消化的碎片 然后将含有原生质体的酶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉于管底，倾去上清液 在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复此步骤3次，使酶解液充分除去； 最后用原生质体培养液离心一次当前15页，总共53页。分离、洗涤、纯化原生质体的试剂试剂分离洗涤纯化KH2PO427.2mgKNO3101mgCaCl2.2H2O1480mgMgSO4.7H2O240mgKI0.16mgCuSO4.5H2O0.025mg甘露醇13%纤维素酶4%果胶酶0.4%蔗糖----21%pH5.65.65.6与分离试剂相同与分离试剂相同当前16页，总共53页。4).原生质体的活力测定

形态： 把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常膨大的一般是有活力的原生质体。 染色法： 用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色 用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，在荧光显微镜下观察到带有荧光的是有活力的原生质体当前17页，总共53页。FDA法的原理FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。荧光素在死细胞中不能积累。在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。当前18页，总共53页。FDA荧光素活细胞死细胞请思考活细胞死细胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为0.01%当前19页，总共53页。原生质体分离纯化流程图当前20页，总共53页。浅层液体培养法：

在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养固体培养法 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察双层培养法

在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基当前21页，总共53页。当前22页，总共53页。

细胞壁再生： 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。 细胞分裂形成细胞团： 一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。 器官形成植株再生： 从愈伤组织诱导发生 胚状体发育当前23页，总共53页。当前24页，总共53页。原生质体的活力 影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度，质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间原生质体密度 起始密度一般为104-105个/mL细胞壁再生速度 植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时所用质膜稳定剂种类原生质体培养的营养和环境 培养基 原生质体培养的环境：光照、温度、湿度当前25页，总共53页。细胞融合(cellfusion)概念： 又称细胞杂交(cellhybridizaion)：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。细胞融合的意义： 克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件当前26页，总共53页。当前27页，总共53页。当前28页，总共53页。植物原生质体融合基本过程当前29页，总共53页。◆盐类融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法◆电融合法当前30页，总共53页。A.盐类融合法盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合当前31页，总共53页。B.高Ca2+和高pH值融合Ca2+浓度0.05mol/L当前32页，总共53页。具体做法(以烟草为例)取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值；两种原生质体的融合率达到10%。当前33页，总共53页。C.聚乙二醇（PEG）融合法Polyethyleneglycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相对分子量200-20000之间融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合用相对分子质量为1540的PEG处理40-50min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体当前34页，总共53页。D.PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥）然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合）再用培养液洗去高Ca2+和高pH值当前35页，总共53页。PEG诱导原生质体融合过程当前36页，总共53页。E.电融合法原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点： 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。当前37页，总共53页。当前38页，总共53页。电融合基本过程将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体,整个过程约10-30分平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体当前39页，总共53页。细胞电融合过程当前40页，总共53页。当前41页，总共53页。原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。当前42页，总共53页。PEG诱导法：PEG规格、纯度，作用时间电诱导法：原生质体密度交流电压交变电场的振幅频率交变电场的处理时间直流高频电压脉冲宽度脉冲次数当前43页，总共53页。A、融合体的类型B、杂种细胞选择的方法C、细胞杂种的鉴定当前44页，总共53页。A、融合体的类型自体融合：发生在亲本原生质体自身异体融合谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株异胞质体细胞杂种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物当前45页，总共53页。B、杂种细胞选择的方法互补选择法(遗传或抗性)： 选择一个叶绿体缺失突变体，这一突变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上，则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织）可见标记法： 凹穴培养皿分离法：根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征之区别 微吸管分离法：用一种向吸管根据可见标记吸取异核体，进行“看护培养”，以获得杂种植物当前46页，总共53页。生长特性选择法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。物理特性选择法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种。其他方法：如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。当前47页，总共53页。异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色◆荧光染料法两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。但仪器价格昂贵，不常用。当前48页，总共53页。当前49页，总共53页。当前50页，总共53页。C、细胞杂种的鉴定（1）杂种植物形态特征、特性鉴定（2）杂种植物的核型分析（3）同工酶分析（4)分子标记鉴定：RFLP鉴定、RAPD 标记鉴定当前51页，总共53页。18条染色体36条染色体当前52页，总共53页。几种细胞融合成功的例子融合生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间叶——叶1972甘蓝——青菜叶——根1972大豆——马唐草愈伤组织——叶1972矮牵牛——龙面花叶——花瓣1973大麦——花生种子——种子