动物性食品中大肠菌群的检验

动物性食品中大肠菌群的检验第1页/共38页一、实验目的1.了解大肠菌群在食品检验中的意义。2.掌握检验的程序和步骤。3.通过MPN检索表的检索得出实验结果。第2页/共38页二、基本原理大肠菌群系指一群在32～37℃下24h内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品中大肠杆菌群数是以每100mL（g）检样内大肠菌群最近似数（MPN）来表示，据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，为报告标准。第3页/共38页1、牛天贵主编《食品微生物学实验技术》实验十二大肠菌群检验2、GB4789.3-2010《大肠菌群计数》3、大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法4、美国FDA标准方法（行业标准采用两步法）：用于对出口食品中大肠菌群进行检验三、检测方法第4页/共38页初发酵分离培养复发酵（证实试验）第5页/共38页实验操作步骤：乳糖发酵试验分离培养证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。

根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

第6页/共38页实验所需培养基及作用乳糖胆盐发酵管（初发酵）伊红美蓝琼脂培养基（鉴别培养基分离培养）乳糖发酵管（复发酵）第7页/共38页1、乳糖胆盐发酵管成分：蛋白胨20g、猪胆盐5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000mL，pH值7.4制法：略实验现象：如图第8页/共38页2、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）成分：蛋白胨10g、乳糖10g、K2HPO42g、琼脂17g，2%伊红Y溶液20mL、0.65%美蓝溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH值7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH值，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用；临用时加入乳糖（115℃20min）并加热融化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液），摇匀后倾注平板。第9页/共38页现象及原理大肠杆菌：菌落深紫色，且有绿色金属光泽；产酸能力较弱的几种肠道菌：也有相应的棕色；不发酵乳糖的肠道菌：菌落是无色透明的，比如变形菌属，沙门氏菌属2、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）第10页/共38页3、乳糖发酵管成分：蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000mL，pH值7.4制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH值，加入指示剂，分装3mL试管，并放入一个小倒管，115℃灭菌15min。第11页/共38页实验操作步骤：1）检样稀释（无菌操作）①将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用8000－10000r/min的速度处理1min）制成1：10的均匀稀释液。②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1：100的稀释液。③另取1mL灭菌吸管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管。第12页/共38页2）乳糖发酵实验

接种1mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土1)℃温箱内培养（24士2)h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。第13页/共38页3）分离培养将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（36士1)℃恒温箱内培养18～24h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。第14页/共38页4）证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2)h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。第15页/共38页取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划线取有核心和带金属光泽的深紫色菌落进行革兰氏染色乳糖蛋白胨培养液镜检（革兰氏阴性菌）37℃培养48h证实产气（阳性）结果与否37℃培养24h37℃培养24h

第16页/共38页实验报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌群的MPN。结果表示方法：120MPN/100mL（g）附表：大肠菌群最大可能数（MPN）检索表第17页/共38页第18页/共38页第19页/共38页第20页/共38页注：①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01mL(g)。每稀释度3管。②表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1ML(g),0.01ML(g）和0.001mL(g）时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。第21页/共38页表10毫升、1毫升、0.1毫升检样各接种3管的大肠杆菌最近似数检索表

阳性管MPN阳性管MPN阳性管MPN10ml1ml0.1ml10ml1ml0.1ml10ml1ml0.1ml00131201123353002612115300230039122203013901031232430264011613016303950129131203104301312132243117502061332931212002192009313160022122011432093023162022032115003092032632221003113210153232900321621120330240033192122733146010042133433211001017220213331100+1021122128

1031522235

110722342

1111123029

1121523136

1131923244

第22页/共38页50ml管阳性数10ml管阳性数1ml管阳性数每100ml的MPN000000110022010101120123020202130224030303150326100110131024103611031115112711391205121712210123121308表2-350毫升检样接种1管、10毫升、1毫升检样各接种3管的大肠杆菌最近似数检索表第23页/共38页二、GB4789.3-2010《大肠菌群计数》第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法第24页/共38页第一法：大肠菌群MPN计数法第25页/共38页

需要用到的培养基（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。第26页/共38页（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.2±0.1。制法：略第27页/共38页抑菌剂的选择大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。第28页/共38页实验步骤及操作要点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；2）样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。第29页/共38页4）初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。第30页/共38页LST结果判断大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。第31页/共38页5）复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。第32页/共38页6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。第33页/共38页表B.1大肠菌群最可能数（MPN）检索表第34页/共38页

三大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法第35页/共38页四、美国FDA标准方法——行业标准采用两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验

推测试验证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤发酵管