分离工程第八章

分离工程第八章第一页，共六十六页，2022年，8月28日本章主要知识点电泳的概念电泳的基本原理电泳技术的分类常用的凝胶电泳技术有哪些？电泳装置的基本组成聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程第二页，共六十六页，2022年，8月28日SDS电泳的基本原理及过程琼脂糖电泳的特点及其应用等电聚焦电泳的基本原理双相电泳的概念及其特点第三页，共六十六页，2022年，8月28日电泳的简单原理蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。第四页，共六十六页，2022年，8月28日第五页，共六十六页，2022年，8月28日电泳：是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。20世纪初，电泳法用于蛋白质的分离，20世纪70年代，电泳多用于分析目的。第六页，共六十六页，2022年，8月28日（1）自由电泳：是最早的一种电泳形式，目前已很少使用。瑞典管内蛋白质溶液和缓和液间有清晰可见界面，然后加一电场，由于界面处存在浓度梯度因而产生折射梯度，利用适当的光学系统可以观察到界面的移动。第七页，共六十六页，2022年，8月28日在电泳过程中，每个移动的界面相当于某一特定的蛋白质，通过一定计算可得其泳动度。第八页，共六十六页，2022年，8月28日缺点：电泳中因通电发热等原因而引起的对流，常回使已分离的溶质重新混合，为防止对流，可将电泳在多孔介质中进行，称为区带电泳。区带电泳：应用支持介质的电泳，它表示在一个电场的作用下，在某一支持物上能将一个样品组成彻底分离成若干条区带的过程。第九页，共六十六页，2022年，8月28日（2）区带电泳：在支持物上电泳时蛋白质混合物被成若干区带。根据支持物物理性质的不同可分为4类：滤纸电泳和薄膜电泳，粉末电泳，细丝电泳，凝胶电泳。多孔介质称为载体，应用最普通的是以滤纸或凝胶为载体故称为纸电泳法或凝胶电泳法。第十页，共六十六页，2022年，8月28日第一节凝胶电泳法凝胶电泳的作用是基于凝胶过滤作用（分子筛作用）和电泳淌度的双重机理，所以它能获得较高的分辨率。凝胶电泳：凝胶过滤作用（分子筛作用）电泳淌度正比于电荷数（电荷效应）单位电场强度下的运动速度称为离子淌度或迁移率。第十一页，共六十六页，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Sizesievingcapacity），这种现象被称为分子筛效应（molecularsievingeffect）第十二页，共六十六页，2022年，8月28日分子筛效应图中A，B，C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为MA=MB>MC，所带电荷量相同QA=QB=QC。ABC+-第十三页，共六十六页，2022年，8月28日常用的凝胶材料：聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶。聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）单体是神经毒素，可积累。凝胶电泳使用的凝胶种类和浓度根据分离料液中溶质的相对分子质量而异。第十四页，共六十六页，2022年，8月28日聚丙烯酰胺含量适用的分子量范围7.5%凝胶10kD~1000kD3.5%凝胶1000kD~5000kD琼脂糖或琼脂糖与聚丙烯酰胺混合物>5000kD孔径从小到大。第十五页，共六十六页，2022年，8月28日垂直电泳槽及灌胶模具第十六页，共六十六页，2022年，8月28日电泳的一般过程第十七页，共六十六页，2022年，8月28日第十八页，共六十六页，2022年，8月28日聚丙酰胺电泳第十九页，共六十六页，2022年，8月28日凝胶电泳与凝胶过滤的区别在凝胶电泳中，样品混合物中各分子的运动速度是小分子大于大分子物质，这种凝胶过滤中的情况恰好相反，这是因为在凝胶电泳中，系统里没有空隙体积，只有充满整体凝胶的网状骨架，因此在其内部大分子物质不及小分子物质容易移动。第二十页，共六十六页，2022年，8月28日常规聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳第二十一页，共六十六页，2022年，8月28日电泳前的准备工作缓冲系统的选择：保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持；电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应限制在3~10之间。第二十二页，共六十六页，2022年，8月28日缓冲系统的选择原则是两种标准的对立权衡如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄；如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高； 因此，常常选择pH8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲液有Tris-甘氨酸（pH8.3~9.5），Tris-硼酸(pH8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH7.2~8.5）第二十三页，共六十六页，2022年，8月28日离子强度的选择离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1mol/L之间第二十四页，共六十六页，2022年，8月28日凝胶浓度的选择由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为：非排阻性凝胶（unrestrictivegel）:浓度0.7~1.0%的琼脂糖凝胶；排阻性凝胶（restrictivegel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE第二十五页，共六十六页，2022年，8月28日凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置；凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离；第二十六页，共六十六页，2022年，8月28日凝胶浓度(C=2.6%)分子量范围(kDa)凝胶浓度(C=5%)分子量范围(kDa)530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150凝胶浓度与分子量测定的关系第二十七页，共六十六页，2022年，8月28日PAGE的具体操作过程制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）；照相、凝胶干燥：定量测定：第二十八页，共六十六页，2022年，8月28日凝胶电泳：装柱操作，铺板操作。近来聚丙烯酰胺凝胶电泳法有了两个新进展：A、不连续凝胶电泳。B、十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳。第二十九页，共六十六页，2022年，8月28日1、不连续凝胶电泳：不连续凝胶由两层组成，上层为浓缩层（丙烯酰胺2~3%），下层为分离层（丙烯酰胺5~25%）。第三十页，共六十六页，2022年，8月28日第三十一页，共六十六页，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺为支持物，制成凝胶柱。凝胶柱由二节凝胶组成（小节浓缩胶，大节分离胶）。这二节胶孔径大小，缓冲液离子成分和离子强度值，电场强度都是不同的。第三十二页，共六十六页，2022年，8月28日样品先被压缩一个薄层，然后进行电泳。一般经过三个效应，浓缩效应，分子筛效应，电荷效应，使样品分离效果好，分辨率高。第三十三页，共六十六页，2022年，8月28日2、十二烷基硫酸钠（SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳一种加阴离子去污剂—SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳。主要用途：分离蛋白质和测定它的相对分子量。第三十四页，共六十六页，2022年，8月28日SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。第三十五页，共六十六页，2022年，8月28日基本原理：SDS能以一定比例与蛋白质结合，并使蛋白质带有大量的负电荷，（大大超过原来所带电荷），从而使天然蛋白质分子之间电荷差别下降乃至消除。同时蛋白质的结构也在SDS作用下变的松散（蛋白质变成多肽），形状趋于一致，排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS—聚丙烯酰胺电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。第三十六页，共六十六页，2022年，8月28日SDS的原理蛋白质分子的解聚SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。第三十七页，共六十六页，2022年，8月28日蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变第三十八页，共六十六页，2022年，8月28日未知蛋白质分子量的测定基于上述SDS的原理介绍，我们可以利用SDS电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；第三十九页，共六十六页，2022年，8月28日LgM

=A-KRmM—相对分子量A—常数K—斜率Rm—迁移率由于蛋白质结合SDS的量与蛋白质种类、pH、I、缓冲液组成有关。一般都必须用已知相对分子量蛋白质作为指示蛋白质、与被测样品在同一条件下进行电泳，给出LgM–Rm曲线，求出样品Rm值对应的LgM，计算出被测样品相对分子量。第四十页，共六十六页，2022年，8月28日第二节等电点聚焦等电点聚焦（IEF)：利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。在电泳设备中首先调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到各自等电点的pH区域形成具有不同等电点的蛋白质区带。第四十一页，共六十六页，2022年，8月28日等电聚焦原理示意图第四十二页，共六十六页，2022年，8月28日装置:第四十三页，共六十六页，2022年，8月28日特点：优点：消除分子扩散引起的分离度下降。缺点：

1、载体两性电解质对产品产生污染；

2、pH梯度的稳定性不高；

3、操作过程中发生凝胶脱水起皱现象。第四十四页，共六十六页，2022年，8月28日载体两性电解质pH梯度等电聚焦等电聚焦（isoelectrofocusing）,IEF

利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。第四十五页，共六十六页，2022年，8月28日工作原理蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectricpointpI）。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析

第四十六页，共六十六页，2022年，8月28日载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。第四十七页，共六十六页，2022年，8月28日等电聚焦分离示意图第四十八页，共六十六页，2022年，8月28日常规PAGE和等电聚焦电泳的区别第四十九页，共六十六页，2022年，8月28日载体两性电解质和pH梯度的形成等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立载体两性电解质的概念：作为载体两性电解质应该具有以下特点：应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置；应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。第五十页，共六十六页，2022年，8月28日用于等电聚焦的主要载体两性电解质Ampholine(瑞典LKB公司)由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比Servalyte(德国Serva公司)产品BiolytePharmalyte(瑞典Pharmacia公司)产品分为九种pH范围第五十一页，共六十六页，2022年，8月28日pH梯度的形成在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。第五十二页，共六十六页，2022年，8月28日其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。第五十三页，共六十六页，2022年，8月28日载体两性电解质在电场中

形成pH梯度的模式图第五十四页，共六十六页，2022年，8月28日水平等电聚焦电泳制胶：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解质等），灌胶；电泳：加样可在凝胶上的任何位置，浓度一般为0.5~2mg/ml；固定：染色：脱色：第五十五页，共六十六页，2022年，8月28日第五十六页，共六十六页，2022年，8月28日等电聚焦的主要应用同工酶分离、分析pI测定 实际应用当中，等电聚焦的操作过程要复杂得多，具体内容可参考《蛋白质电泳实验技术》，作者：郭尧君，科学出版社。第五十七页，共六十六页，2022年，8月28日双相电泳第一相等电聚焦第二相SDS－PAGE目的：为了获得更详细的组分信息目前已经广泛应用于蛋白质组研究中第五